鐘亞珍 林賢雷 陸金華 林勝友

[摘要] 目的 初步探討龜鹿二仙膠通過降低腫瘤周圍T淋巴細胞PD-1表達，抑制T細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長的分子機制。 方法 采用皮下接種H22肝癌細胞株方法建立荷瘤小鼠模型，觀察藥物干預(yù)后各組荷瘤小鼠腫瘤的生長速度，Annexin V/PI雙染色法測定小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡比例，分離腫瘤浸潤性T淋巴細胞，流式細胞檢測PD-1陽性細胞的比例。 結(jié)果 （1）龜鹿二仙膠呈劑量依賴抑制皮下瘤的生長，順鉑組及高、中、低劑量組抑瘤率分別為81.36%、79.64%、48.86%、21.96%;（2）順鉑組及高、中、低劑量組小鼠T淋巴細胞凋亡比例分別為早期（24.37±0.32）%、（5.30±0.21）%、（6.90±0.16）%、（11.93±2.01）%;晚期（8.83±1.23）%、（4.73±0.33）%、（6.40±0.34）%、（7.47±0.54）%，說明與順鉑組比較，龜鹿二仙膠能夠抑制小鼠T淋巴細胞凋亡;（3）龜鹿二仙膠高劑量組、中劑量組的PD-1表達陽性細胞比分別為（11.73±0.54）%、（20.00±0.66）%，明顯低于生理鹽水組（32.57±0.65）%和順鉑組（31.83±0.43）%，說明龜鹿二仙膠能夠降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例。 結(jié)論 龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，其機制可能是通過抑制PD-1表達，減少T淋巴細胞凋亡，增強機體免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細胞得以實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 龜鹿二仙膠;T淋巴細胞;PD-1;凋亡

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）36-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Guilu Erxianjiao in inhibiting tumor growth and inhibiting T cell apoptosis by reducing the expression of PD-1 in T lymphocytes around the tumor. Methods The tumor-bearing mouse model was established by subcutaneous inoculation of H22 hepatoma cell line. The growth rate of tumor-bearing mice in each group was observed after drug intervention. Annexin V/PI double staining was used to detect the percentage of apoptosis of mouse spleen T lymphocytes. Tumor infiltrating T lymphocytes were isolated. The proportion of PD-1 positive cells was detected by flow cytometry. Results （1）Guilu Erxianjiao inhibited the growth of subcutaneous tumors in a dose-dependent manner. The tumor inhibition rate of cisplatin group and high， medium and low dose groups was 81.36%， 79.64%， 48.86% and 21.96%， respectively. （2）The percentages of T lymphocyte apoptosis in the cisplatin group， high， medium and low dose groups were early （24.37±0.32）%， （5.30±0.21）%， （6.90±0.16）%， （11.93±2.01）%， and late （8.83±1.23）%， （4.73±0.33）%， （6.40±0.34）%， （7.47±0.54）%， indicating that compared with cisplatin group， Guilu Erxianjiao could inhibit the apoptosis of mouse T lymphocytes. （3）The ratio of PD-1 positive cells in Guilu Erxianjiao high dose group and medium dose group of was（11.73±0.54）% and （20.00±0.66）%， which was significantly lower than that in the saline group （32.57±0.65）% and cisplatin group （31.83±0.43）%， indicating that Guilu Erxianjiao could reduce the proportion of PD-1 positive in tumor infiltrating T lymphocytes. Conclusion Guilu Erxianjiao has the effect of inhibiting tumor growth. This may be achieved by inhibiting PD-1 expression， reducing T lymphocyte apoptosis， enhancing immunity to inhibit and kill tumor cell.

[Key words] Guilu Erxianjiao; T lymphocytes; PD-1; Apoptosis

近年來，隨著對腫瘤免疫逃逸機制的深入了解，通過阻斷程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體1（PD-1 ligand，PD-L1）構(gòu)成的PD-1/PD-L1通路、重新激活機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用成為了一種新的腫瘤治療策略[1-2]。PD-1/PD-L1抑制劑目前適用于多種類型腫瘤，但總體治療人群有效率在20%左右[3]，雙抗以及和放化療、抗血管治療藥物的聯(lián)合治療一定程度提高了腫瘤治療反應(yīng)率，但也伴有較高的副作用，與此同時，獲得性耐藥也是目前免疫治療的難點。

課題組前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可以有效抑制化療小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡，對患者的免疫功能具有一定的保護作用[4]，進一步研究龜鹿二仙膠的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過建立荷瘤小鼠模型，觀察化療及中藥治療后小鼠T淋巴細胞凋亡情況及腫瘤浸潤性T淋巴細胞中PD-1陽性細胞的比例，初步探討其可能的抗腫瘤效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

6～8周齡健康的SPF級近交系小鼠（從上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購得），生產(chǎn)許可證號：SCXK（*）2012-0002，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為18℃～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達40%～70%，晝夜明暗交替。

1.2 藥物和細胞株

按龜板膠6 g、鹿角膠9 g、枸杞子15 g、生曬參9 g比例組成復(fù)方，中藥飲片由杭州市腫瘤醫(yī)院中藥房采購，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所制劑，根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算等效劑量方法，煎汁，過濾，濃縮至100%濃度，使每毫升含生藥1 g，分裝，置4℃冰箱備用。順鉑粉劑購自杭州市腫瘤醫(yī)院藥房（批號：1WA2A160100）。H22肝癌細胞購自中科上海細胞庫。

1.3 試劑

青鏈霉素混合液（100X）購自Solarbio公司（貨號：P1400-100）;淋巴細胞分離液購自CEDARLANE公司（貨號：CL5020）;胎牛血清購自GIBCO公司（貨號：16000-044）;RMPI-1640購自Hyclone公司（貨號：SH30809.01B）;Anti-PD1 antibody 購自Abcam公司（貨號：ab95791）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號：C1062）。

1.4 主要儀器

離心機為上海盧湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品，顯微鏡為上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，CO2恒溫培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品，流式細胞儀為BD產(chǎn)品。

1.5 細胞培養(yǎng)

H22肝癌細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2 濃度和100% 濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 建立荷瘤小鼠模型

選用正常傳代的H22肝癌細胞，接種于小鼠腹腔，無菌取腹水，用PBS稀釋成腫瘤細胞懸液，離心收集細胞，待腹水生成后抽取腹水，調(diào)整細胞濃度為1.5×107個/mL。將H22細胞200 μL（3×106個）接種于小鼠腋部皮下，大約1～2周后成瘤。

1.7分組及藥物給藥

實驗分為陰性對照組（生理鹽水組）、化療對照組（順鉑組）、龜鹿二仙膠高劑量組、龜鹿二仙膠中劑量組、龜鹿二仙膠低劑量組共5組，每組3只。

藥物干預(yù)方式：陰性對照組腹腔注射生理鹽水（0.2 mL），化療對照組腹腔注射順鉑3 mg/（kg·d），兩組均灌胃生理鹽水0.3 mL;龜鹿二仙膠高劑量組、中劑量組、低劑量組灌胃龜鹿二仙膠劑量（分別為0.38 g、0.19 g、0.095 g）：各劑量組均腹腔注射生理鹽水0.2 mL，連續(xù)給藥9 d（d1～d9）。

1.8 計算荷瘤小鼠抑瘤率

最后一次干預(yù)后24 h將小鼠脫頸椎處死，剖取腋部皮下腫瘤組織稱重，分別計算加藥組的腫瘤抑制率。公式為：腫瘤抑制率（%）=（模型組平均瘤重-藥物干預(yù)組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.9 流式細胞術(shù)檢測藥物對細胞凋亡率的影響

脾切除后，用PBS漂洗2～3次，于5 mL離心管中剪成碎泥狀后過細胞篩，PBS沖洗2～3次，收集濾液。離心后收集單核細胞層并用PBS洗滌3次，PBS重懸制備成1×108個/mL單核細胞懸液。每100 μL細胞加入20 μL CD3+磁珠抗體，4℃孵育15 min后buffer（PBS、0.5% FBS）洗滌2次，用500 μL buffer重懸細胞（細胞數(shù)≤108），并于磁場中分選（4℃）。潤洗，將細胞懸液過柱，收集未被磁性標(biāo)記的細胞，重復(fù)操作2次，所收集細胞即為CD3-T淋巴細胞。PBS洗滌2次后重懸備用。?。?～10）×104重懸的細胞，離心，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻。避光孵育10 min。離心，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞后加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.10流式檢測腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1表達陽性的比例

處死小鼠無菌條件下取得瘤體標(biāo)本，除去黃色脂肪組織及血塊置于PBS緩沖液中浸泡5 min，充分剪碎，研磨制成單細胞懸液，經(jīng)小鼠淋巴細胞分離液梯度離心后收集白膜層，培養(yǎng)基重懸，置入250 mL培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁2 h。收集未貼壁細胞，其中即含有腫瘤浸潤性T淋巴細胞，PBS洗滌3次，重懸細胞后制備成單細胞懸液，之后1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，使用抗小鼠PD-1抗體 4℃ 30 min染色后上機檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龜鹿二仙膠能夠抑制腫瘤生長

實驗表明，龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果顯示順鉑和高中低劑量處理組抑瘤率分別為81.36%、79.64%、48.86%、21.96%，與空白對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=165.31，P=0.013），其中順鉑組、龜鹿二仙膠高、中劑量組與生理鹽水組相比具有顯著抑制腫瘤的作用（F=218.24，P=0.008）。

2.2 龜鹿二仙膠能夠抑制荷瘤小鼠T淋巴細胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染法分析顯示：與順鉑組比較，龜鹿二仙膠各劑量組小鼠T淋巴細胞早期凋亡比均減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=158.41，P=0.011），高中劑量組小鼠T淋巴細胞晚期凋亡比減少（F=156.63，P=0.018），說明龜鹿二仙膠能夠抑制荷瘤小鼠T淋巴細胞凋亡，且抑制作用與劑量呈正相關(guān)。

2.3 龜鹿二仙膠能夠降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例

與生理鹽水和順鉑組比較，龜鹿二仙膠高、中劑量組的PD-1表達陽性細胞比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.08，t=18.91，P=0.014;F=1.83，t=18.37，P=0.015;F=1.76，t=17.64，P=0.016;F=1.71，t=16.93，P=0.017），且龜鹿二仙膠呈劑量依賴的方式抑制PD-1陽性T細胞的表達;生理鹽水組和順鉑組間比較PD-1表達陽性細胞比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），說明順鉑的抗腫瘤作用與調(diào)節(jié)T細胞PD-1表達不相關(guān)。

3 討論

腫瘤免疫治療是通過調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強抗腫瘤免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細胞，以PD-1抗體、PD-L1抗體為代表的免疫檢查點抑制劑是目前臨床研究的熱點。程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）存在PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）兩個配體，可與T細胞表面受體PD-1結(jié)合，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用[5]。PD-1是一種重要的免疫檢查點，可廣泛表達于多種細胞，例如B細胞、T細胞以及NK/T細胞等[6-8]，腫瘤細胞表面往往具有異常高表達的PD-L1分子，與腫瘤浸潤T淋巴細胞表面的PD-1分子結(jié)合，在腫瘤微環(huán)境中抑制T細胞活化的免疫應(yīng)答，避免腫瘤細胞被T細胞殺傷，最終實現(xiàn)腫瘤的免疫逃逸[9-10]。而抗PD-1或PD-L1抗體能夠阻斷腫瘤表面PD-L1和T細胞表面PD-1的結(jié)合，消除這一免疫抑制效應(yīng)，使得T細胞重新被激活，識別并殺傷癌細胞[11-13]。在腫瘤部位，抗PD-1抗體還可以結(jié)合巨噬細胞表面的Fcγ受體，介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的消耗，從而上調(diào)T細胞的比例，增強抗腫瘤能力[14]。

現(xiàn)代藥理表明，益氣養(yǎng)陰類中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。龜鹿二仙膠為中醫(yī)傳統(tǒng)古方，該方由鹿角膠、龜板、人參、枸杞子四味藥物組成，《醫(yī)方考》、《古今名醫(yī)方論》認(rèn)為其具有大補元氣、益精生血、陰陽并補之效。相關(guān)實驗結(jié)果表明龜鹿二仙膠具有提高細胞免疫的作用，陳萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠聯(lián)合激素替代周期治療能夠提高卵巢早衰患者外周血中的CD3+T細胞、CD4+T細胞水平，從而提高患者免疫功能、改善患者臨床癥狀。錢鈞等[19]研究發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙湯能有效升高 CD4+，降低 CD8+，從而提高 CD4+/CD8+的比值，使免疫功能對機體抗腫瘤作用處于更有利的狀態(tài)。師林等[20]實驗結(jié)果表明用加味龜鹿二仙膠湯合用化療不僅可以縮小腫瘤病灶，還能夠調(diào)節(jié)細胞免疫功能。

結(jié)合以上，課題組提出龜鹿二仙膠可以通過恢復(fù)T細胞活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的假說。實驗結(jié)果顯示：龜鹿二仙膠以劑量依賴的方式抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長;同時給予龜鹿二仙膠處理后荷瘤小鼠脾臟T淋巴細胞凋亡減少，這種抑制作用具有劑量依賴性，尤其是當(dāng)T淋巴細胞處于凋亡晚期時，高劑量組仍具有抑制作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠中、高劑量可以降低腫瘤浸潤T淋巴細胞中PD-1陽性的比例。

綜上所述，本研究初步顯示龜鹿二仙膠具有抑制腫瘤生長的作用，其機制可能是通過抑制PD-1表達，減少T淋巴細胞凋亡，恢復(fù)T細胞活性實現(xiàn)的，由于腫瘤免疫的過程復(fù)雜，多種機制的共同作用影響了免疫檢查點藥物的療效，具體的內(nèi)在機制有待于進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] Finn OJ.A believers overview of cancer immunosurveillance and immunotherapy[J]. J Immunol，2018，200（2）：385-391.

[2] Armand P. Immune checkpoint blockade in hematologic malignancies[J]. Blood，2015，125（22）：3393-3400.

[3] Su Q，Zhang X，Shen X，et al.Risk of immune-related colitis with PD-1/PD-L1 inhibitors vs chemotherapy in solid tumors：Systems assessment[J].J Cancer，2018，9（9）：1614-1622.

[4] 林勝友，沈敏鶴，陳健，等.龜鹿二仙膠抵抗化療小鼠脾T淋巴細胞凋亡的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28（4）：339-342.

[5] Ribas A. Adaptive immune resistance：How cancer protects from immune attack[J]. Cancer Discovery，2015，5（9）：915.

[6] Brahmer JR，Pardoll DM. Immune checkpoint inhibitors：Making immunotherapy a reality for the treatment of lung cancer[J]. Cancer Immunol Res，2013，1（2）：85-91.

[7] Dong H，Strome SE，Salomao DR，et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：Apotential mechanism of immune evasion[J]. Nat Med，2002，8（8）：793-800.

[8] Keir ME，Butte MJ，F(xiàn)reeman GJ，et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J]. Annual Review of Immunology，2008，26（1）：677-704.

[9] Garciadiaz A，Shin DS，Moreno BH，et al. Interferon receptor signaling pathways regulating PD-L1 and PD-L2 expression[J]. Cell Reports，2017，19（6）：1189.

[10] Kataoka K，Shiraishi Y，Takeda Y，et al. Aberrant PD-L1 expression through 3'-UTR disruption in multiple cancers[J]. Nature，2016，534（7607）：402-406.

[11] Blank CU. The perspective of immunotherapy：New molecules and new mechanisms of action in immune modulation[J]. Current Opinion in Oncology，2014，26（2）：204-214.

[12] Philips GK，Atkins M.Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies[J]. Int Immunol，2015，27（1）：39-46.

[13] Gunturi A，McDermott DF. Nivolumab for the treatment of cancer[J]. Expert Opinion on Investigational Drugs，2015， 24（2）：253-260.

[14] Topalian SL，Drake CG，Pardoll DM.Targeting the PD-1/B7-H1（PD-L1）pathway to activate anti-tumor immunity[J].Current Opinion in Immunology，2012，24（2）：207-212.

[15] 肖寒，楊進. 加味四君子湯對大腸癌化療患者的免疫促進作用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（2）：164-167.

[16] 王洪武，賈亮亮，徐媛青，等.五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（4）：144-146.

[17] 宋洋，方美云，姜鳳，等.人參皂苷Rg3促樹突狀細胞誘導(dǎo)作用的實驗研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6（8）：2120-2123.

[18] 陳萍，李靈芝，李桂華.加味龜鹿二仙湯輔助西醫(yī)激素替代周期治療對卵巢早衰患者免疫功能及治療效果的影響[A].中國中藥雜志2015/專集：基層醫(yī)療機構(gòu)從業(yè)人員科技論文寫作培訓(xùn)會議論文集[C].北京：中國中藥雜志編輯部，2016：129-130.

[19] 錢鈞，林勝友.龜鹿二仙湯對非小細胞肺癌患者化療后外周血白細胞與細胞免疫功能的影響研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2014，46（4）：35-37.

[20] 師林，柯斌，李永浩.加味龜鹿二仙膠湯對非小細胞肺癌化療患者免疫功能的影響[J].新中醫(yī)，2012，44（8）：74-76.

（收稿日期：2018-06-22）