王榮，覃海媚，陸玉蘭，黃華佗，藍(lán)艷 ，王俊利，韋葉生

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1. 檢驗科； 2. 皮膚科，廣西 百色 533000）

微小RNA （microRNA，miRNA） 是由19～25個核苷酸構(gòu)成的非編碼小RNA分子，通過和靶mRNA的3’非編碼區(qū)序列結(jié)合后降低mRNA的穩(wěn)定性或抑制翻譯，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1］。近些年來，研究者對miRNA與疾病的關(guān)系產(chǎn)生了濃厚的興趣，最具有代表性的是miR-17-92基因簇。它由6種成熟的miRNA （miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1） 組成。研究［2］發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌多種細(xì)胞系中表達(dá)，而且在生物學(xué)行為不同的同種腫瘤細(xì)胞系中也存在差異表達(dá)。在實體腫瘤組織中，miR-17-92在B細(xì)胞淋巴瘤及直腸癌等中呈不同的表達(dá)狀態(tài)，提示miR-17-92或可作為潛在的腫瘤預(yù)防和治療的新分子靶標(biāo)［3-4］。miRNA基因啟動子區(qū)多態(tài)性可影響miRNA的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響miRNA相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。但是，尚未見文獻(xiàn)報道關(guān)于miR-17-92基因簇啟動子區(qū)遺傳多態(tài)性的研究。因此，本研究采用多重單堿基延伸和DNA測序技術(shù)，檢測miR-17-92基因簇啟動子區(qū)的rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點的基因型，并分析其多態(tài)性在不同正常人群中的差異。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取我院體檢中心275例健康體檢者，其中男98例，女177例，年齡17～78歲。排除肝、腎、心臟及腫瘤史等疾病，各臨床及實驗室檢查均正常。研究對象均是來自廣西的無親緣關(guān)系個體。研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批后進(jìn)行，研究對象均知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA制備：采用EDTAK2抗凝采血管抽取研究對象靜脈血3 mL。取200 μ L血液按照北京天根公司的全血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA，置于-20 ℃保存待用。

1.2.2 引物合成：參考miR-17-92基因簇啟動子區(qū)rs14911033A/C位點和rs1813389A/G位點的核苷酸序列，采用 Primer3.0 引物在線設(shè)計軟件 （http：//primer3.ut.ee/） 設(shè)計針對本研究的特異性引物，交由上海天昊生物科技有限公司合成。rs14911033A/C位點上游引物：5’-TGGGGTTTCTTCAGGGGATAAT TG-3’，下游引物：5’-TGTTCTGAGTGGAGGGCCCTT AT-3’，延伸引物：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTGTAAACTAAGCTTTGTTTTGCCTGTT-3’；rs1813389A/G位點上游引物：5’-TCGGGGGAGAATA AACGAGAGG-3’，下游引物：5’-TCGCCAGTGCATT AAGCCCTAC-3’，延伸引物：5’-TTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTCAGCCAGAGTGGATCAACCTT-3’。

1.2.3 基因分型：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總共20 μ L，包括1.0 μ L樣本DNA、2.0 μ L緩沖液、2.0 μ L dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μ L，剩余體積添加滅菌的雙蒸水。使用熱啟動Taq聚合酶 （Hotstar Taq，德國Qiagen 公司） 進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶 （SAP，日本Promega公司） 和核酸外切酶Ⅰ （EXO1，美國Epicentre 公司） 純化后用美國ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物采用SAP純化后在ABI 3730XL上樣，并用Gene Mapper 4.1 （美國Applied Biosystems公司） 分析。運(yùn)用DNA測序法驗證上述分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。直接計數(shù)法統(tǒng)計各位點的基因型及等位基因頻率。采用χ2檢驗比較各組基因多態(tài)性分布差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡法則驗證樣本人群是否有代表性。

2 結(jié)果

2.1 rs1491033A/C和rs1813389A/G基因分型

經(jīng)檢驗2個位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P= 0.287，P= 0.084） ，說明本研究選取的樣本人群有代表性。rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點的擴(kuò)增長度分別為232 bp、281 bp。分 型 結(jié) 果 顯 示，rs1491033A/C有AA、AC、CC 3種基因型，頻率分別為21.1%、53.1%、25.8%；rs1813389A/G有AA、AG、GG 3種基因型，頻率分別為40.0%、50.2%、9.8%。測序結(jié)果充分證實了上述分型結(jié)果 （圖1、2） 。

2.2 廣西人群中2個位點的基因多態(tài)性分布

rs1491033A/C位點AA、AC、CC基因型及A、C等位基因頻率分布在男女間比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05） 。rs1813389A/G位點AA、AG、GG基因型及A、G等位基因頻率分布在男女間比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05） 。見表1。

2.3 各位點與其他人群的基因多態(tài)性比較

廣西人群rs1491033A/C位點基因型和等位基因分布頻率與歐洲人、非洲人相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05） ，與北京人和日本人相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞ 0.05） 。廣西人群rs1813389A/G位點基因型及等位基因分布頻率與歐洲人、非洲人、北京人及日本人相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見表2。

圖1 miR-17-92基因簇rs1491033A/C位點測序圖Fig.1 Sequencing map of the genotype for the rs1491033A/C site in the miR-17-92 gene cluster

圖2 miR-17-92基因簇rs1813389A/G位點測序圖Fig.2 Sequencing map of the genotype for the rs1813389A/G site in the miR-17-92 gene cluster

表1 廣西人群miR-17-92基因簇rs1491033A/C、rs1813389A/G位點基因型及等位基因頻率的分布Tab.1 The distribution of genotype and allele frequencies of rs1491033A/C and rs1813389A/G sites in the miR-17-92 gene cluster in the Guangxi population

3 討論

miRNA-17-92基因簇位于人類第13號染色體上（13q31-32） ，C13orf25基因的第3個內(nèi)含區(qū)，其轉(zhuǎn)錄前體含有6個串聯(lián)莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，屬于高度保守的基因［5］。在人體的正常生長發(fā)育中，miRNA-17-92基因簇參與機(jī)體的免疫系統(tǒng)、心肺和血管生長等分化過程。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，它主要是通過抑制細(xì)胞周期調(diào)控基因和抑癌基因的表達(dá)實現(xiàn)的。抑癌基因p53以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transduction and activator of transcription 3，STAT3） 均可與miR-17-92基因簇啟動子區(qū)結(jié)合，激活miR-17-92基因簇轉(zhuǎn)錄，通過抑制其靶基因引發(fā)腫瘤［6-7］。最新研究［8］發(fā)現(xiàn)，其家族成員可通過對細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)節(jié)因子p21蛋白的抑制而增強(qiáng)白血病干細(xì)胞的增殖能力，從而在混合譜系白血病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。此外，miR-17-92基因簇還可通過抑制抑癌基因PTEN和促凋亡蛋白基因Bim的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，這些作用由轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路介導(dǎo)［9］，這些研究表明miR-17-92基因簇在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用。

單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 是指在基因組DNA序列中由于單個核苷酸 （A、G、C、T） 替換而引起的多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始時間和表達(dá)的程度。啟動子區(qū)SNP可影響基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致與之相關(guān)疾病的發(fā)生［10-11］。本研究采用SNaPshot SNP分型技術(shù)和DNA測序法檢測275例廣西人群rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點，并將所得結(jié)果與HapMap公布的不同人群比較，分析不同種族、地區(qū)人群間2個位點多態(tài)性的分布差異。結(jié)果表明，廣西人群rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點的基因型和等位基因頻率在不同性別間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞ 0.05） ，表明廣西人群中這2個位點的多態(tài)性與性別無關(guān)。進(jìn)一步將2個位點結(jié)果與HapMap公布的不同人群比較發(fā)現(xiàn)，rs1491033A/C基因型和等位基因頻率廣西人群與歐洲人和非洲人比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.01） ，而與北京人和日本人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞ 0.05） 。rs1813389A/G位點基因型和等位基因頻率廣西人群與歐洲、北京、日本和非洲人群比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05） 。廣西人群中miR-17-92基因簇rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點多態(tài)性與其他種族、地區(qū)人群存在不同程度的差異。這種差異可能與本地區(qū)飲食習(xí)慣、生活環(huán)境和自然選擇等因素有關(guān)。這也體現(xiàn)了不同的遺傳背景下，其多態(tài)性存在著不同的多態(tài)性差異。

總之，本研究首次開展對廣西人群miR-17-92基因簇rs1491033A/C位點和rs1813389A/G位點多態(tài)性的研究，并和不同地區(qū)、人群進(jìn)行比較，不僅為miR-17-92基因簇多態(tài)性的群體遺傳學(xué)普查提供了資料，同時為其與相關(guān)疾病的研究奠定了遺傳學(xué)方面的基礎(chǔ)。國內(nèi)學(xué)者陶陶等［12］關(guān)于microRNA在卵巢漿液性癌化療耐藥及敏感組織的差異表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-17-92 基因簇與卵巢漿液性癌化療耐藥有關(guān)。而基因多態(tài)性差異影響疾病的發(fā)病率和耐藥性。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步研究miR-17-92基因簇多態(tài)性和疾病的關(guān)系。

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