馬劍，孔繁菲，叢蓉，馬曉欣

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110020）

子宮內(nèi)膜癌在女性常見的致命惡性腫瘤中居第五位，其發(fā)病率逐年增高［1］。子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)為主，放化療及激素等藥物治療為輔，但對于晚期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者，由于失去手術(shù)時機，治療失敗率仍然很高。隨著對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展分子機制的深入研究，越來越多的分子靶向藥物已得到初步的臨床應(yīng)用，取得了一定的療效［2-3］。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復(fù)雜的多因素過程，因此，探索子宮內(nèi)膜癌進展過程中的潛在改變可能為子宮內(nèi)膜癌的分子治療以及判斷內(nèi)膜癌的預(yù)后和檢測提供新的策略［4］。小腦鋅指結(jié)構(gòu) （zinc finger of the cerebellum，ZIC） 家族基因包括5個成員，ZIC基因各自編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，組成5個Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)域。ZIC蛋白被認為在基因表達監(jiān)管中發(fā)揮作用，影響ZIC基因表達，從而影響其他多種基因的表達［5］。ZIC基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用，與多種腫瘤，包括胃癌、肝癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6-7］。ZIC4作為ZIC基因家族中的重要一員，在多種腫瘤，如肺癌、頭頸癌、卵巢癌等［8-10］中扮演著重要的角色。然而，ZIC4在子宮內(nèi)膜癌中的表達和意義目前暫無報道。本研究擬檢測子宮內(nèi)膜癌、非典型增生子宮內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜組織中ZIC4的表達，并分析ZIC4表達與臨床病理資料之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：收集中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院2011至2017年期間因子宮內(nèi)膜癌、非典型增生和宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級 （cervical intraepithelial neoplasiaⅢ，CINⅢ） 行手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜組織。制成石蠟標本，共160例，相應(yīng)分為子宮內(nèi)膜癌組 （n= 110）、非典型增生子宮內(nèi)膜組 （n= 20） 和正常對照組 （n=30） ?；颊咝g(shù)前均未接受放化療及激素治療，且已經(jīng)病理確診。子宮內(nèi)膜癌組手術(shù)臨床分期及病理分級（FIGO 2009）為Ⅰ期 30例，Ⅱ期 30例，Ⅲ期 30 例，Ⅳ期20例 ；組織學分級 （WHO標準）為高分化子宮內(nèi)膜癌38 例，中分化以及低分化子宮內(nèi)膜癌72 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性27 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 83 例；浸潤肌層＜1/2共61 例，浸潤肌層≥1/2 共49 例。從The Cancer Genome Atlas （TCGA） 數(shù)據(jù)庫獲取542例子宮內(nèi)膜癌患者生存信息并分析。本研究已通過中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 主要試劑：ZIC4兔抗人一抗購自北京博奧森公司，免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接 （S-P） 試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 S-P法免疫組化檢測：標本經(jīng)固定、石蠟包埋，制備成子宮內(nèi)膜石蠟標本，5 μ m 厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟，TritonX-100 破核，檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)，進而按免疫組化S-P試劑盒說明書進行操作，ZIC4一抗?jié)舛葹?1∶800，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗藍化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片固定。

1.2.2 結(jié)果判定：采用雙盲評分法對免疫組化結(jié)果進行判定，并由2位觀察者閱片，以確保實驗可信性。ZIC4 蛋白陽性反應(yīng)顆粒定位于細胞核。在 400 倍視野下隨機選取 5個視野，按陽性細胞著色強度進行評分，無著色計為 0 分，淺黃色計為 1 分，黃色計為2 分，棕黃色以及棕褐色計為 3 分。每張切片在 400倍光學顯微鏡下取3 個高倍視野觀察，按陽性細胞數(shù)所占百分比評分，評分后取均值，陰性計為 0 分，陽性細胞百分比≤10% 計為 1 分，＞10%～50% 計為2 分，＞50%～75% 計為 3 分，＞75% 計為 4分。取2項評分的乘積作為總分，≤2 分為陰性 （ - ），3～4分為弱陽性 （ + ），5～8 為中等陽性 （ ++ ） ，9～12 分為強陽性（+++ ） 。-/+為低表達，++/+++為高表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料的比較采用χ2或 Fisher 確切概率檢驗。分析生存情況采用 Kaplan-Meier法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織中ZIC4的表達

ZIC4蛋白主要表達于子宮內(nèi)膜組織細胞核中，陽性表達呈棕黃色、棕褐色均勻顆粒狀或片狀。免疫組化結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組ZIC4陽性率［ 94.5%（104/110） ］和非典型增生組陽性率［55% （11/20） ］顯著高于正常對照組［23.3% （7/30） ］ （P＜ 0.001，P=0.022 3） 。見圖1。

2.2 ZIC4在子宮內(nèi)膜癌中的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖1 ZIC4在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達 SP×400Fig.1 ZIC4 expression in the endometrial tissue from each group SP×400

如表1所示，高分化子宮內(nèi)膜癌組織中ZIC4高表達率明顯低于中低分化子宮內(nèi)膜癌，早期 （Ⅰ～Ⅱ期） 內(nèi)膜癌組織中ZIC4 高表達率明顯低于晚期（Ⅲ～Ⅳ期） 內(nèi)膜癌，腫瘤浸潤深度≥1/2子宮內(nèi)膜癌組織中ZIC4高表達率明顯高于浸潤＜1/2者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者ZIC4的高表達率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義 （均P＜0.05） 。而ZIC4表達水平與年齡無相關(guān)性 （P＞ 0.05） 。

2.3 ZIC4基因表達的生存分析

對應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫獲取的子宮內(nèi)膜癌患者信息進行單因素Keplan-Meier 分析，結(jié)果顯示，ZIC4高表達與總體生存期縮短明顯相關(guān) （P＜ 0.05） ，見圖2。

圖2 ZIC4表達與子宮內(nèi)膜癌患者生存期及無病生存率的單因素Keplan-Meier 分析Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of cases with high and low ZIC4 expression levels in patients with endometrial cancer

3 討論

ZIC基因最早于1994年由ARUGA等［11］在篩選成年鼠小腦cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)，因在小腦顆粒細胞里大量編碼鋅指蛋白表達而命名為ZIC基因，1995年ZIC基因被克?。?2］。此后，ZIC基因家族的其他成員ZIC2～5逐漸被人們發(fā)現(xiàn)［13］。全部5個ZIC基因都具有三外顯子結(jié)構(gòu)，其中鋅指結(jié)構(gòu)域編碼位于每個基因的C-末端。鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合DNA序列，也可被Gli鋅指蛋白結(jié)合，Gli蛋白和 ZIC鋅指結(jié)構(gòu)域中也存在類似的特異性結(jié)合序列［14-15］。ZIC報告基因的激活在一定程度上依賴于 Gli 靶序列的存在［16］。Gli 蛋白在SHH （ Sonic hedgehog） 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演至關(guān)重要的角色，在細胞的分化、增殖、遷移侵襲以及凋亡等生理過程中起著舉足輕重的作用［17］。ZIC1和ZIC4在人染色體3號 （小鼠染色體9） 緊密連接。ZIC4在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中通常與ZIC1一起工作［18］。PALUSZCZAK等［19］發(fā)現(xiàn)頭頸癌細胞中ZIC1和ZIC4基因的啟動子被甲基化，Wnt信號通路被激活，其中ZIC4甲基化與口腔癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，ZIC4的甲基化被認為可能是新的頭頸鱗狀細胞癌預(yù)后指標。已有研究結(jié)果表明，血漿DNA的ZIC1啟動子甲基化速率對于GC的早期篩選和腫瘤發(fā)生的監(jiān)測具有重要意義。ZIC1啟動子甲基化速率和CEA水平 （并行測試） 的組合檢測可以提高胃癌的早期診斷率［20］，也有研究［21］認為ZIC1啟動子的甲基化可能作為肝癌的潛在生物學指標。此外，在甲狀腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中均可檢測到ZIC1基因表達異常，以及啟動子發(fā)生甲基化［22-23］。以上研究說明 DNA 甲基化可能是ZIC基因調(diào)控的重要機制之一。已有文獻［24］報道ZIC1基因在子宮內(nèi)膜癌組織中過表達，但在正常組織中低表達，ZIC1的表達下調(diào)有助于抑制細胞增殖，抑制腫瘤生長。關(guān)于ZIC4與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)研究暫無報道。本研究通過免疫組化法檢測了ZIC4在不同子宮內(nèi)膜石蠟組織中的表達，結(jié)果表明 ZIC4在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達。本研究還分析了ZIC4表達與臨床病理資料間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZIC4的表達高低與臨床分期、組織分化、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。同時，本研究分析了ZIC4與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果提示子宮內(nèi)膜癌中ZIC4高表達可導(dǎo)致預(yù)后生存率較差。

綜上所述，本研究提示ZIC4與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。深入研究ZIC4在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用機制將有可能為子宮內(nèi)膜癌的治療以及預(yù)后監(jiān)測提供新的策略。

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