余世聰，梁 浩，李 壯

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】油菜是一種重要的油料作物，在我國(guó)的食用油市場(chǎng)占有無(wú)法取代的地位。一直以來(lái)，油菜種子中不同脂肪酸含量的調(diào)控都是油菜品質(zhì)育種的核心。油菜按照其形態(tài)和特性可以分為白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜，其中甘藍(lán)型油菜的種植面積最大。所以，甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育過(guò)程中脂肪酸合成相關(guān)基因的篩選與功能鑒定，具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】在對(duì)甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育前、后兩個(gè)時(shí)期種子EST文庫(kù)SSH消減中，前人發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與油脂合成相關(guān)的候選基因,命名為BnaLCR78。通過(guò)序列比對(duì)，該基因的cDNA電子克隆序列與擬南芥LCR23基因的同源性最高，預(yù)測(cè)屬于LCR基因家族[1]。已知的擬南芥LCR基因家族包含86個(gè)成員，目前已經(jīng)注釋的LCR家族基因主要有兩個(gè)功能，一部分被認(rèn)為參與植物的防御反應(yīng),另一些基因則被認(rèn)為具有輔助開(kāi)花植物柱頭快速識(shí)別花粉的能力。這類(lèi)LCR基因很大部分可以編碼一個(gè)小片段PCP(pollen coat protein)蛋白家族。PCP蛋白家族往往含有一個(gè)可以與SLG結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu)域。1998年人們首次得到油菜PCP-A1基因序列，通過(guò)原位雜交，確定該基因作用區(qū)域定位在油菜花粉壁并推測(cè)這個(gè)基因編碼是一個(gè)花粉壁防御蛋白(defensin-like protein )[2]。在對(duì)自交不親和基因SLG(S locus glycoprotein)的研究中發(fā)現(xiàn)，編碼PCP-A1的基因與SLG有連鎖效應(yīng)，具備結(jié)合SLG的能力[3]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，油菜PCP-A1蛋白還可與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白SLR1 (S locus-related glycoprotein 1)結(jié)合，增強(qiáng)柱頭的粘性[4]。同年，能與SLR1結(jié)合的SLG-BP蛋白被分離出來(lái)，對(duì)SLR1基因的沉默表達(dá)驗(yàn)證PCP-A1通過(guò)與SLR1結(jié)合影響花粉與柱頭的結(jié)合[5]。對(duì)擬南芥LCR23突變體的形態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，這一突變體和野生型在花粉管生長(zhǎng)和受精過(guò)程中并無(wú)明顯差異。但是LCR23突變體的種子花生烯含量降低16 %，芥酸含量升高了7 %。故而推測(cè)其具備在擬南芥種子發(fā)育中調(diào)控脂肪酸的合成的功能。此后對(duì)AtLCR23基因研究中發(fā)現(xiàn)這一基因在擬南芥盛放的花中較高表達(dá)，在剛形成的果莢中少量表達(dá)。使用AtLCR23基因?qū)@一擬南芥突變體互補(bǔ)表達(dá)證明這個(gè)基因在已授粉花的柱頭及花絲花藥中和發(fā)育前期果莢的柱頭上有所表達(dá)，印證AtLCR23基因與授粉和果莢發(fā)育相關(guān)[6]。使用用BnaLCR78基因?qū)M南芥野生型和LCR23突變體過(guò)表達(dá)所得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株相比野生型呈現(xiàn)明顯的長(zhǎng)勢(shì)弱小、開(kāi)花提前、結(jié)實(shí)率低、種子解構(gòu)松散、種皮表面刺突數(shù)目減少。轉(zhuǎn)基因植株對(duì)環(huán)境敏感，葉片易感病死亡，抗病性降低[1]。利用BnaLCR78基因互補(bǔ)擬南芥LC23突變體以得到性狀恢復(fù)的預(yù)估尚未實(shí)現(xiàn)。長(zhǎng)久以來(lái)，前人將研究的重點(diǎn)集中于脂肪酸合成相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證[7-8]，脂肪酸合成通路中的眾多相關(guān)基因被研究得相當(dāng)深入[9]。油菜油脂合成是多基因調(diào)控的一個(gè)性狀，新基因的發(fā)現(xiàn)與研究對(duì)未來(lái)油菜品質(zhì)育種很有指導(dǎo)意義。BnaLCR78候選基因的功能研究仍然處于初級(jí)階段，目前尚無(wú)法明確這個(gè)基因在油菜發(fā)育階段中的具體功能。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)在高油酸材料(保持系100B的高油酸航空誘變材料)中克隆得到BnaLCR78基因的基因組和cDNA序列，分析其在油菜種子發(fā)育期中不同階段的表達(dá)量，預(yù)測(cè)該基因的蛋白功能并構(gòu)建該基因的過(guò)表達(dá)載體。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為后續(xù)深入研究該基因在甘藍(lán)型油菜中的功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 高油酸材料(保持系100B的高油酸航空誘變材料，本實(shí)驗(yàn)室留存)。

1.1.2 質(zhì)粒、工具酶及試劑 P-EASY-simple-T載體、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α購(gòu)自全式金公司。表達(dá)載體pCAMBIA1301購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)公司。植物DNA提取試劑盒、DEPC、Tris、RT-PCR試劑盒、DNA純化回收試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、LATaqDNA聚合酶、dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；KOD FX DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；DNA Marker DL2000 DL5000、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)于天根生化，trizol購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，PCR熱循環(huán)儀(BIO-RAD)，ABI Prism7300熒光定量?jī)x，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，恒溫振蕩器，超凈臺(tái)，恒溫?fù)u床，超低溫冰箱。

1.2 油菜DNA提取

取0.1 g葉片在液氮中充分研磨后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，加預(yù)熱的2×CTAB提取液800 μl，搖勻后65 ℃ 輕搖溫浴45 min；加等體積氯仿︰異戊醇(24︰1)，至下層液體變?yōu)樯罹G，10 000 r/min離心10 min，取上清，重復(fù)上一步驟；取上清，加等體積異丙醇(預(yù)先置于4 ℃冰箱中)，勻混1～2 h，-20 ℃冰箱冷藏30 min。平轉(zhuǎn)EP管直至DNA析出后挑至離心管，用400 μl 75 %乙醇洗滌2次，無(wú)水乙醇洗滌1次；風(fēng)干DNA，加入適量無(wú)菌水溶液充分溶解后， -20 ℃保存[10]。

1.3 第一鏈cDNA的合成

采用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取油菜總RNA。取0.1 g葉片在液氮中充分研磨后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，再加1 mL的Trizol充分混勻。將勻漿樣品室溫下放置5 min，加入氯仿至管口，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4 ℃、1200 r/min離心10 min。取水相，轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入500 μl異丙醇，混勻，室溫放置20 min。4 ℃、1200 r/min離心10 min，去上清。加入1 mL的75 %乙醇洗滌沉淀，去上清，重復(fù)上一步驟。放置晾干后，加入40 μl的RNase-free ddH2O(RF-H2O)充分溶解RNA，電泳檢測(cè)紫外定量后-70 ℃保存。使用DNAaseI去除基因組DNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA第一鏈。

1.4 BnaLCR78 基因組DNA和cDNA序列克隆

根據(jù)彭琦公布的BnaLCR78的基因組序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為：5’-ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAG-3’/5’-TCATAACTTATTGTTGTA CCAGAACACACC -3’。反應(yīng)模板分別選取提取所得DNA和反轉(zhuǎn)錄所得cDNA第一鏈。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，35個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物用瓊脂糖純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收(Tiangen,北京)。產(chǎn)物與P-EASY-simple-T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Escherichiacoli)DH5α(TransGen Biotech, 北京)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選, 經(jīng)PCR鑒定確定為陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)化子由上海Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。在GenBank中檢索分析測(cè)序結(jié)果。利用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用CBS(http://www.cbs.dtu.dk/)網(wǎng)站在線(xiàn)工具ProtParam預(yù)測(cè)理化性質(zhì)。從NCBI網(wǎng)站CDD庫(kù)獲得BnaLCR78結(jié)構(gòu)域。利用IBCP(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的在線(xiàn)工具SOPMA，對(duì)BnaLCR78蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html)在線(xiàn)預(yù)測(cè)BnaLCR78的亞細(xì)胞定位, Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)對(duì)BnaLCR78三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 不同組織中基因的表達(dá)檢測(cè)

按照前文敘述的方法制備油菜油菜開(kāi)花后27 和35 d的根、莖、葉、果莢cDNA第一鏈。采用TaqMAN 探針?lè)ㄑ芯炕虻谋磉_(dá)(Life Technology, USA)。引物序列如下： 5’-TTGATTGTCGTCAAAA CTGCTATG-3’/5’-TCTCCACCAGCTTTAACATCTTTAAC-3’ Probe: 5’-ACAATGGAGTTGGAAAAT-3’；β-actin內(nèi)參引物序列如下：5’-CCTGGAATTGCTGACCGTATG-3’/5’-TGCGACCACCTTGATCTTCA -3’, Probe: 5’-CAAAGAGATCACGGCGCTCGCAC-3’為對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，80 ℃ 2 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在MJ Research PTC-200熒光定量PCR儀上運(yùn)行, 3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.7 表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)加入NcoI酶切位點(diǎn)的引物F(5’-GACCATGGCGAAGCTATCATGTTCT-3’)，R(5’-TACCATGGAACAATTCCAATTATAAGTAC-3’)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收得到所需的目的片段。以NcoI內(nèi)切酶酶切pCAMBIA1301載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收。使用T4連接酶連接載體和目的片段的回收產(chǎn)物。經(jīng)PCR、單酶切后鑒定檢測(cè)是否構(gòu)建成功。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaLCR78基因克隆

以高油酸甘藍(lán)型油菜的基因組DNA為模板，可以擴(kuò)增得到全長(zhǎng)376 bp的BnaLCR78核酸片段， BLAST結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank登錄的全基因組測(cè)序序列(LOC106418077)相似度達(dá)到97.07 %，由此認(rèn)為克隆得到了BnaLCR78基因的基因組全長(zhǎng)序列。BnaLCR78的基因組PCR擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的拼接序列有所差異，克隆片段在第78～85位堿基處多出7個(gè)堿基，該片段屬于內(nèi)含子區(qū)域；基因外顯子區(qū)域的擴(kuò)增序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中電子序列相比有3個(gè)點(diǎn)突變，但均為無(wú)義突變，不影響蛋白序列預(yù)測(cè)結(jié)果(圖1)。

使用cDNA為模版克隆可以得到兩段長(zhǎng)度不同的cDNA片段。其中一條長(zhǎng)237 bp的片段與網(wǎng)上公布的該基因的cDNA電子克隆序列相似度很高。另一段長(zhǎng)376 bp的片段與這個(gè)基因的基因組全長(zhǎng)序列一致(圖1)。在BnaLCR78中，這一變化會(huì)造成片段翻譯提前終止，無(wú)法通讀(圖2)。說(shuō)明在高油酸材料的BnaLCR78基因的轉(zhuǎn)錄中存在內(nèi)含子保留型可變剪切。

2.2 BnaLCR78基因同源性分析

將BnaLCR78基因使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)Blast的結(jié)果表明，BnaLCR78與擬南芥LCR23基因同源性最高，該基因?qū)儆贚CR基因家族。經(jīng)此繪制出BnaLCR78與擬南芥LCR基因家族的同源樹(shù)(圖3)表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)LCR21、LCR22、LCR23、LCR24、LCR27、LCR36和琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)LCR26、LCR27 基因序列與BnaLCR78相似度較高，在線(xiàn)Blast結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與BnaLCR78預(yù)測(cè)蛋白序列接近的蛋白序列多數(shù)出現(xiàn)在雙子葉植物中。根據(jù)這一特征選擇了選擇了16種常見(jiàn)植物與BnaLCR78相近的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，在不同被子植物種中的相似的蛋白序列均含由高度保守的半胱氨酸位點(diǎn)。從繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，BnaLCR78基因與十字花科植物中相似序列最為接近(圖4)。

BnaLCR78 genome DNA：BnaLCR78 電子克隆的基因組序列；G-BnaLCR78 genome DNA：高油酸材料中克隆出的DNA基因組序列； G-BnaLCR78-2：內(nèi)含子保留型的BnaLCR78的cDNA克隆序列。BnaLCR78 cDNA ：BnaLCR78的cDNA電子克隆的序列；G-BnaLCR78-1：不保留內(nèi)含子型的BnaLCR78的cDNA克隆序列；粗下劃線(xiàn)標(biāo)示內(nèi)含子,細(xì)下劃線(xiàn)標(biāo)示與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相比添加的片段序列圖1 高油酸油菜BnaLCR78基因序列與電子克隆序列的比較Fig.1 Alignment between BnaLCR78 gene sequence in induced, high oleic acid content types of rape and BnaLCR78 gene in electronic cloning

2.3 BnaLCR78蛋白生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

ProtParam工具預(yù)測(cè)表明：BnaLCR78基因編碼一個(gè)含有78個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，分子量8709.07，等電點(diǎn)(pI)4.42。該多肽鏈帶負(fù)電殘基(Asp + Glu) 10個(gè)，帶正電殘基(Arg + Lys) 6個(gè)。其脂肪指數(shù)77.31，親水系數(shù)0.162，高于蛋白質(zhì)平均值，說(shuō)明這個(gè)酶既有親水性，又有一定的親脂性。該多肽鏈的測(cè)算穩(wěn)定系數(shù)18.76，較為穩(wěn)定。SOPMA工具預(yù)測(cè)顯示，BnaLCR78蛋白分別由25、27、19個(gè)氨基酸殘基組成的α-螺旋(alpha helix)、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)、延伸鏈(extended strand)結(jié)構(gòu)組成(圖8)。亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白定位于液泡和細(xì)胞器以外。CDD在線(xiàn)分析顯示，BnaLCR78基因可以編碼SLR1-BP結(jié)構(gòu)域，屬于PCP家族，具備特異性識(shí)別SLR1分泌蛋白的能力(圖5)。利用Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BnaLCR78進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖6)發(fā)現(xiàn)該預(yù)測(cè)蛋白由分子兩端的α螺旋結(jié)構(gòu)包裹形成一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)小分子。

2.4 BnaLCR78在不同組織中的表達(dá)

G-BnaLCR78-2：保留內(nèi)含子的BnaLCR78核苷酸序列；G-BnaLCR78-1：不保留內(nèi)含子的BnaLCR78序列推導(dǎo)的氨基酸序列以大寫(xiě)單字母符號(hào)表示，終止密碼子以星號(hào)(*)表示圖2 BnaLCR78 的2種核苷酸序列CDS區(qū)及其推測(cè)編碼的氨基酸序列Fig.2 Two different CDS of BnaLCR78 and their deduced amino acids

LCR基因家族核苷酸和蛋白序列來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)化距離分析均采用最大似然法圖3 擬南芥LCR基因家族與高油酸油菜BnaLCR78基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Cladogram of LCR gene family from Arabidopsis and BnaLCR78 gene from high oleic acid content types of rape

為了初步研究該基因的表達(dá)模式，對(duì)BnaLCR78在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，這個(gè)基因在根和葉中的表達(dá)水平很低，而在莖組織中較高。油菜果莢里，BnaLCR78在開(kāi)花后27 d的脂肪酸積累初期的表達(dá)量依然很低，然而在開(kāi)花后35 d的脂肪酸積累期的果莢中表達(dá)水平迅速提高，接近莖組織內(nèi)的2倍(圖7)。

2.5 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

篩選可以通讀的cDNA片段構(gòu)建pCambia1301-BnaLCR78重組質(zhì)粒，備于后續(xù)研究。為了驗(yàn)證表達(dá)載體pCambia1301-BnaLCR78是否被成功構(gòu)建，采用NcoI單酶切的方式進(jìn)行酶切鑒定。從圖8中可以看出,用NcoI單酶切后發(fā)現(xiàn)，在250 bp左右，切出一條清晰的目的條帶，說(shuō)明該表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功。

3 討 論

BnaLCR78克隆序列片段與油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中158號(hào)預(yù)測(cè)防御蛋白(defensin-like protein)基因(LOC106418128)相同，為同一基因。到目前為止，油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)了47個(gè)防御蛋白基因，均未找到明確的功能注釋[11]。在基因克隆過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中未曾預(yù)測(cè)到的可變剪切?？勺兗羟衅毡榇嬖谟谡婧松锏幕虮磉_(dá)過(guò)程中，在高等植物中具有重要的作用?；虻那绑wmRNA，通過(guò)不同的剪切方式，產(chǎn)生不同的mRNA剪切異構(gòu)體?？勺兗羟惺钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要原因，導(dǎo)致蛋白組的多樣性[12-13]。在植物中，可變剪切的研究集中在剪切復(fù)合體的發(fā)現(xiàn)和可變剪切在植物抗逆作用中發(fā)揮的功能上[14]。普遍認(rèn)為，植物干旱、寒冷、病害等脅迫的抗逆作用中可以發(fā)現(xiàn)植物可變剪切發(fā)揮作用[15-16]，而進(jìn)來(lái)研究更發(fā)現(xiàn)，可變剪切在擬南芥生物鐘調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能[17]，也會(huì)對(duì)蕓薹屬植物花期產(chǎn)生影響[18]。除了環(huán)境因素誘發(fā)之外，對(duì)染色體加倍的甘藍(lán)型油菜可變剪切的研究表明，染色體加倍的子代與母本相比，可變剪切發(fā)生改變的油菜等位基因比例很高[19-20]。高油酸100B保持系的BnaLCR78基因的cDNA克隆得到兩條長(zhǎng)度為237、376 bp的序列。經(jīng)過(guò)比對(duì)確認(rèn)，BnaLCR78基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)內(nèi)含子保留型可變剪切。這一內(nèi)含子保留型mRNA導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄中提前終止，使得油菜在種子發(fā)育過(guò)程中可以通過(guò)這一方式調(diào)整這個(gè)基因的功能發(fā)揮。BLAST比對(duì)后，驗(yàn)證了前人BnaLCR78基因序列與擬南芥LCR家族中AtLCR23基因相近的結(jié)論。前人對(duì)AtLCR23基因的半定量RT-PCR和GUS染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)LCR23基因在授粉和果莢發(fā)育前期的表達(dá)，并由此推斷出LCR23在花粉識(shí)別和果莢發(fā)育中承擔(dān)了相關(guān)功能[6]。雖然在氨基酸序列比對(duì)中，BnaLCR78蛋白序列與LCR23存在一些差異，但是在功能上可能仍然比較相似。油菜種子發(fā)育時(shí)期果莢內(nèi)的油份的積累具有明顯的源庫(kù)關(guān)系和時(shí)間性。以在開(kāi)花后20 d內(nèi)，油份積累僅占成熟種子的8.35 %～12.32 %，果莢內(nèi)油份多積累于果皮。開(kāi)花40 d后，油份積累量達(dá)成熟種子油份含量的 72.89 %～94.73 %，果皮內(nèi)的油酸向種子轉(zhuǎn)移。說(shuō)明開(kāi)花后20～40 d的種子發(fā)育中至后期是油菜種子脂肪酸積累期[21]。通過(guò)對(duì)BnaLCR78基因在不同時(shí)期和不同器官中的表達(dá)量分析證明，在種子發(fā)育過(guò)程前期(27 d)，該基因在果莢中幾乎不表達(dá)；進(jìn)入種子發(fā)育后期(35 d)，基因表達(dá)量迅速上升，大量表達(dá)，印證了彭琦等前期研究的結(jié)論[1]?？梢酝茰y(cè)BnaLCR78基因可能與油菜種子的脂肪酸代謝及存儲(chǔ)有關(guān)。BnaLCR78蛋白包含一個(gè)可以識(shí)別并結(jié)合SLR1分子的SLR1-BP結(jié)構(gòu)域，普遍認(rèn)為， PCP蛋白家族的結(jié)構(gòu)蛋白通常具備這個(gè)結(jié)構(gòu)。利用反義載體將SLR1基因反義表達(dá)導(dǎo)致花的柱頭對(duì)花粉的粘著力下降，降低授粉效率[5]。針對(duì)水稻SLR1蛋白研究發(fā)現(xiàn)，SLR1作為一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，通過(guò)與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的DELLA蛋白結(jié)合來(lái)影響該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[22]。所以BnaLCR78可能是一種可以結(jié)合SLR1蛋白的受體蛋白，通過(guò)油菜種子發(fā)育后期的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控來(lái)影響脂肪酸的合成和積累。

a：蛋白序列比對(duì),BnaLCR78與其他物種的氨基酸保守殘基用陰影顯示；b：蛋白質(zhì)進(jìn)化距離,利用最大似然法進(jìn)化樹(shù)分析17個(gè)生物中相似蛋白基于保守結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系圖4 BnaLCR78蛋白序列與不同物種中與相近序列多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree of BnaLCR78 protein between Brassica napus and some similar species

圖5 BnaLCR78結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Conserved domains of BnaLCR78 in Brassica napus

圖6 BnaLCR78蛋白三維構(gòu)象預(yù)測(cè)Fig.6 Modeling of BnaLCR78

圖7 開(kāi)花后27和35 d不同部位的熒光實(shí)時(shí)定量PCRFig.7 Result of RTqPCR in various organs 27 and 35 days after flowering

圖8 pC1301-Bn78單酶切檢測(cè)(BnaLCR78基因237 bp)Fig.8 Single digestion analysis of pC1301-Bn78 vector (BnaLCR78 gene 237 bp)

前人使用用擬南芥AtLCR23突變體過(guò)量表達(dá)BnaLCR78基因無(wú)法得到互補(bǔ)表達(dá)，轉(zhuǎn)化得到的擬南芥幼苗出現(xiàn)形態(tài)變異。在擬南芥轉(zhuǎn)化過(guò)程中，BnaLCR78基因是一個(gè)異源基因，不同種屬間基因的不親和性往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)化苗t0代和t1代變異。這個(gè)異源基因的導(dǎo)入可能導(dǎo)致了擬南芥植株的遺傳變異或沉默[23]。所以本試驗(yàn)選擇全長(zhǎng)237 bp的可通讀cDNA序列，成功構(gòu)建PC1301-BnaLCR78過(guò)表達(dá)載體，以便于繼續(xù)研究這個(gè)問(wèn)題。

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