郭麗紅， 李 念， 徐 亞， 曾潔媛

(1.昆明學(xué)院云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214；2.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214)

【研究意義】在自然界中各種農(nóng)作物遭受各種逆境脅迫時(shí)表達(dá)一系列防御基因，產(chǎn)生相應(yīng)的耐逆境生理、生化途徑，從而獲得耐逆境能力。擬南芥熱激因子AtHsfA1a是與耐逆境有關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，抗壞血酸過氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)是在逆境中參與抗逆性形成的重要抗氧化酶，進(jìn)一步鑒定熱激因子AtHsfA1a與APX基因的關(guān)系，對于揭示熱激因子AtHsfA1a生理功能的作用機(jī)制具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控防御基因表達(dá)中起重要作用。植物熱激因子(heat shock transcription factors，HSFs)是真核生物熱激反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[ 1-2 ]。正常生長條件下，HSF是以非活性單體的形式存在，逆境脅迫誘導(dǎo)HSF形成有活性的三體，而與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的熱激元件(heat shock element, HSE)特異性結(jié)合，以調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而控制生理功能[3-5 ]。在擬南芥中存在21個(gè)熱激因子的同源體，組成熱激因子家族[ 4]。雖然目前對絕大多數(shù)同源體的功能還不了解，但研究顯示其中熱激因子AtHsfA1a是與耐逆境有關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子[ 5-7 ]。研究也發(fā)現(xiàn)各種逆境脅迫均可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度的增加而導(dǎo)致氧化脅迫，最終導(dǎo)致植物死亡[ 8-10 ]。然而植物細(xì)胞中的抗氧化酶系統(tǒng)可以把細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的具有很強(qiáng)氧化活性的活性氧直接或間接地清除，保障了細(xì)胞內(nèi)各種生命代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行[ 11-13 ]。目前關(guān)于熱激因子與抗氧化酶關(guān)系的研究主要集中在抗壞血酸過氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)上，Storozhenko等研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫可以誘導(dǎo)Apx1基因表達(dá)[14 ]，Panchuk，et al.于2002年研究發(fā)現(xiàn)擬南芥過量表達(dá)HSF3可以使熱脅迫下的抗氧化酶Apx活性高于野生型[ 15 ]，且出現(xiàn)新的同工酶，Apx的mRNA水平也高于野生型。研究還發(fā)現(xiàn)Apx的啟動(dòng)子包括熱激因子HSF的結(jié)合位點(diǎn)[15 ]。然而，AtHsfA1a 對APX的影響研究不多，并且在逆境中，由于逆境信號的級聯(lián)反應(yīng)，很難區(qū)分HSFs直接與靶DNA結(jié)合以調(diào)控抗APX基因的表達(dá)，還是由處理逆境引起細(xì)胞產(chǎn)生的其它反應(yīng)而導(dǎo)致APX基因的表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】本研究以T-DNA 插入AtHsfA1a基因突變擬南芥及野生型植株為材料，比較熱脅迫下不同基因型植株的抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化，從生理水平揭示細(xì)胞內(nèi)AtHsfA1a突變對APX活性的影響；為了研究AtHsfA1a 對APX影響的分子機(jī)制，采用RT-PCR分析熱脅迫不同基因型植株APX基因的表達(dá)水平，采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和凝膠阻滯電泳研究AtHsfA1a與APX基因啟動(dòng)子區(qū)的體內(nèi)外結(jié)合情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從生理生化和分子水平鑒定AtHsfA1a與APX的關(guān)系，為揭示熱激因子AtHsfA1a在逆境中的作用機(jī)制和生理功能范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥哥侖比亞種(Arabidopsisthaliana，ecotype Columbia)，包括野生型(簡稱WT)和T-DNA 插入AtHsfA1a基因突變擬南芥(SALK-068042, 購于美國生物資源中心ABRC, 簡稱MT )。

1.2 方法

1.2.1 材料栽培及高溫處理 種子用0.1 %的HgCl2和70 %的乙醇進(jìn)行滅菌處理后，接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基[15]中，置于25 ℃光照下萌發(fā)。待種子長出4片真葉，把小苗移至土壤中，用保鮮膜遮蓋，在生長室培養(yǎng)3 d后去膜，恒溫培養(yǎng)。取生長4周的小苗進(jìn)行高溫處理：將洗凈后的擬南芥植株置于SIB Buffer(0.5 mmol/L K2HPO4，0.5 mmol/L KH2PO4，1 % 蔗糖，pH 6.0) 中，42 ℃高溫處理10 min。對照實(shí)驗(yàn)的處理溫度為25 ℃。

1.2.2 抗壞血酸過氧化物酶活性的測定 取葉片0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加1 mL預(yù)冷的提取液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 值 7.0，含20% 甘油，5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA，1 mmol/L ASA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L GSH)冰浴研磨成勻漿,于4 ℃下15 000 r/min離心30 min，取上清液備用。在25 ℃水浴中預(yù)熱30 min反應(yīng)混合液 (50 mmol/LTris-HCl 緩沖液，pH 7.0，內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA)2.890 mL。加入10 mmol/L H2O230 μl，酶液50 μl，最后加入30 mmol/L ASA 50 μl以啟動(dòng)反應(yīng)，終體積為3 mL。每隔10 s讀出OD290的減少值來計(jì)算酶活性。

1.2.3 抗氧化酶基因的mRNA的測定 總RNA提取采用QIAGEN RNA提取試劑盒，用 1.5 %的凝膠電泳(120V)15 min，在凝膠成像儀下檢測總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照下列配方：RNA/mRNA(8 μl)、Trans criptTmRT/RI Enzyme Mix(1 μl)、Anehored Oligo(dT)18(1 μl)、2×TS Reaction Mix(10 μl)，RNase-free Water to 20 μl,輕輕混勻后,在水浴鍋中42 ℃孵育30 min后，在85 ℃的水浴鍋中加熱5 min失活Trans ScriptTmRT。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR的模板，以APX啟動(dòng)子片段為引物(APX-F： 5’-CGGCGTTATTATCGTCAG-3’，APX-R：5’-AAGCAGGAGTGAGCTACAGA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 以Actin-F: 5'-TTGTCACACACAAGTGCATCAT-3'; Actin-R: 5'- AAGCTGGGGTTTTATGAATGG-3'為對照。程序如下： 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃10 min，35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)分析AtHsfA1a與APX基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合 按照Guo LH (2008)等方法[ 5 ]，將上述逆境處理后的小苗，在室溫下浸入crossing buffer 中(0.4 mmol/L sucrose, 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF, 1 % formaldehyde),在真空下培養(yǎng)15 min后 加入終濃度為100 mmol/L甘氨酸在真空下培養(yǎng)5 min以終止交聯(lián)反應(yīng)。小苗用無菌去離子水沖洗后，按照Guo，et al.的方法，利用AtHsfA1a專一性抗體，進(jìn)行免疫沉淀，所獲得的沉淀DNA，用APX基因啟動(dòng)子區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 凝膠阻滯電泳(EMSA)分析AtHsfA1a與APX基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合 凝膠阻滯電泳(EMSA)按照Guo LH (2008)等方法[ 5 ]，40 ng AtHsfA1a 與 40 fmol 生物素標(biāo)記的HSE-探針在25 ℃ 共培養(yǎng) 20 min后用凝膠阻滯電泳分析。在競爭實(shí)驗(yàn)中, 加入獲得的APX基因啟動(dòng)子區(qū)片段。以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(BSA)作為負(fù)對照，用于AtHsfA1a結(jié)合片段的特異性研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱激因子AtHsfA1a突變對擬南芥幼苗在熱脅迫中APX酶活性的影響

WT：野生型；MT：T-DNA插入突變型WT: Wild-type plants； MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a圖1 不同基因型擬南芥植株在熱脅迫下APX的活性變化Fig.1 Activity of APX in different genotypes of Arabidopsis thaliana plants under heat stress

WT：野生型；MT：T-DNA插入突變型 WT: Wild-type plants;MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a 圖2 不同基因型擬南芥植株在熱脅迫下APX的表達(dá)情況Fig.2 Expression of APX in different genotypes of Arabidopsis thaliana plants under heat stress

為了從生理水平揭示細(xì)胞內(nèi)AtHsfA1a 對APX活性的影響，測定熱脅迫下AtHsfA1a基因突變擬南芥和野生型植株中APX酶活性變化，結(jié)果如圖1所示，在對照環(huán)境中(25 ℃)下，2種基因型植株的APX的活性差異不大，但在熱脅迫42 ℃下處理10 min后，野生型植株中的活性升高較大，但AtHsfA1a基因突變擬南芥活性的變化沒有野生型的明顯，說明擬南芥AtHsfA1a突變對熱脅迫中APX活性有影響。

2.2 熱激因子AtHsfA1a突變對擬南芥幼苗在熱脅迫中APX表達(dá)的影響

為了研究AtHsfA1a 對APX影響的分子機(jī)制，采用RT-PCR法比較熱脅迫下不同基因型植株中APX的表達(dá)量，以肌動(dòng)蛋白(Actin)為內(nèi)參，從圖2可知，野生型的APX基因42 ℃下的表達(dá)量高于25 ℃的表達(dá)量，且野生型的APX的表達(dá)量在2種溫度下均比AtHsfA1a基因突變植株的高，說明在熱脅迫下AtHsfA1a突變能夠影響抗氧化酶APX基因的表達(dá)。

2.3 CHIP體內(nèi)鑒定AtHsfA1a與APX的基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合狀況

為了研究AtHsfA1a在體內(nèi)的表達(dá)水平是如何影響抗氧化酶APX基因的表達(dá)，應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chip)體內(nèi)篩選AtHsfA1a的靶DNA，以AtHsfA1a的靶DNA為模板，以APX基因啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行Promotor-specific-PCR擴(kuò)增,體內(nèi)鑒定AtHsfA1a與抗氧化酶的基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合狀況，其結(jié)果如圖3。

從圖3可以知道，在熱脅迫下，以抗氧化酶APX基因啟動(dòng)子區(qū)的片段為引物，野生型植株有擴(kuò)增產(chǎn)物，而AtHsfA1a基因突變擬南芥植株無擴(kuò)增條帶，說明AtHsfA1a在體內(nèi)能與抗氧化酶APX的基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，影響抗氧化酶APX的表達(dá)。

2.4 EMSA體外鑒定AtHsfA1a與APX的基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合狀況

T DNA：總DNA；CHIP DNA：染色質(zhì)免疫沉淀DNA；WT：野生型，MT：T-DNA插入突變型T DNA：Total DNA；IP DNA：Chromatin immunoprecipitation DNA； WT: Wild-type plants, MT: T-DNA inserted mutant of Arabidopsis AtHsfA1a圖3 CHIP體內(nèi)驗(yàn)證AtHsfA1a與抗氧化酶APX的基因啟動(dòng)子區(qū)的體內(nèi)結(jié)合狀況Fig.3 The binding of AtHsfA1a to the promoter regions of APX investigated by using chromatin immunoprecipitation

HSE* ：生物素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)的熱激元件；BSA：標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白HSE* ：Biotin labeled perfect heat shock element；BSA：Standard bovine serum albumin圖4 EMSA體外驗(yàn)證AtHsfA1a與抗氧化酶APX的基因啟動(dòng)子區(qū)片段的結(jié)合狀況Fig.4 The binding of AtHsfA1a to the promoter regions of APX investigated by using electrophoretic mobility shift assay

為了研究AtHsfA1a對抗氧化酶APX基因的表達(dá)影響是直接的還是間接的，設(shè)計(jì)含有熱激元件(HSE)的保守片段(GAATTC)進(jìn)行人工合成，生物素標(biāo)記合成的DNA片段。選擇染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chip)體內(nèi)篩選出的能被APX啟動(dòng)子區(qū)引物擴(kuò)增片段為競爭性片段，標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(BSA)用于AtHsfA1a結(jié)合片段的特異性進(jìn)行研究。采用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA) 體外鑒定AtHsfA1a與APX的啟動(dòng)子區(qū)域的特異性片段的結(jié)合情況，結(jié)果如圖4。從圖4可知,在EMSA中染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chip)體內(nèi)篩選出APX1基因啟動(dòng)子區(qū)片段能特異性地與熱激元件競爭結(jié)合AtHsfA1a，體外驗(yàn)證了AtHsfA1a直接與APX的基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，進(jìn)一步說明了AtHsfA1a對APX的影響是直接的。

3 討 論

植物對高溫抵抗能力的變化與細(xì)胞生理生化的一系列適應(yīng)性變化有關(guān)。熱脅迫損傷細(xì)胞膜系統(tǒng)并導(dǎo)致氧化脅迫，抗氧化酶系統(tǒng)的增強(qiáng)與提高植物的抗逆性密切相關(guān)[ 8-10 ]。前期研究均表明抗氧化酶APX在逆境中可以通過活性升高或表達(dá)量的增加而提高抗逆性。擬南芥HSF是一個(gè)大的蛋白質(zhì)家族，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥HSF除調(diào)控?zé)峒さ鞍妆磉_(dá)外，也可調(diào)控一些非熱激蛋白的表達(dá)，例如擬南芥HSF3可以在熱脅迫下可以提高抗氧化酶Apx活性，同時(shí)Apx的mRNA水平也提高[15]，研究還發(fā)現(xiàn)Apx的啟動(dòng)子包括熱激因子HSF的結(jié)合位點(diǎn)[14]，說明擬南芥HSF家族與APX密切相關(guān)。然而，擬南芥AtHsfA1a 與APX的關(guān)系研究不多。研究者前期利用熱激因子AtHsfA1a基因沉默植株研究發(fā)現(xiàn)AtHsfA1a對APX有影響。本研究采用T-DNA 插入AtHsfA1a基因突變擬南芥植株的目的是該植株由于T-DNA 插入導(dǎo)致AtHsfA1a基因的無法正常表達(dá)，研究結(jié)果表明T-DNA 插入AtHsfA1a基因突變植株的APX活性要比野生型植株中的活性弱，從生理水平說明體內(nèi)AtHsfA1a與APX活性有關(guān)。關(guān)于AtHsfA1a是直接調(diào)控APX的活性，還是調(diào)控APX的表達(dá)需要進(jìn)一步研究。為了從分子水平研究AtHsfA1a與APX表達(dá)的關(guān)系，本研究采用RT-PCR分析熱脅迫不同基因型植株APX基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明AtHsfA1a基因突變植株中的APX的mRNA的相對量低于野生型，說明AtHsfA1a可以誘導(dǎo)APX的表達(dá)。雖然目前研究顯示逆境誘導(dǎo)熱激因子調(diào)控抗氧化酶APX基因的表達(dá)；然而很難區(qū)分HSFs直接與靶DNA結(jié)合以調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，還是由處理逆境引起細(xì)胞產(chǎn)生的其它反應(yīng)而影響APX的表達(dá)。由于染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)可以找出在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄因子與靶DNA序列的結(jié)合位點(diǎn)，從而反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況，而凝膠阻滯電泳 (EMSA)又稱為電泳遷移率變動(dòng)分析，它是一種在體外證實(shí)目的蛋白與DNA直接結(jié)合的方法[5]。因此采用了染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和凝膠阻滯電泳研究AtHsfA1a與APX基因啟動(dòng)子區(qū)片段的結(jié)合情況，體內(nèi)和體外鑒定APX是否是熱激因子直接調(diào)控的下游靶基因。結(jié)果表明，在熱脅迫下AtHsfA1a基因突變擬南芥植株中未篩選出APX基因啟動(dòng)子區(qū)片段，而野生型篩選出APX基因啟動(dòng)子區(qū)片段，且AtHsfA1a與APX基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是直接的，初步說明AtHsfA1a對APX表達(dá)的調(diào)控是直接的。

4 結(jié) 論

熱激因子AtHsfA1a突變對熱脅迫中擬南芥APX的影響是從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平直接影響APX的表達(dá)，這將為揭示熱激因子AtHsfA1a在逆境中的作用機(jī)制和生理功能范圍提供理論依據(jù)。

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