張 磊，孫曉棠，唐子清，葉夢斐，崔汝強

(江西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，江西 南昌 330045)

水稻作為世界范圍內(nèi)種植的主要糧食作物之一，其產(chǎn)量受多種病原物影響。在水稻抗病過程中，篩選和利用水稻抗病基因尤為重要。木質(zhì)部半胱氨酸蛋白酶為植物與病原物互作中重要的酶類，而植物基因組大約編碼140種半胱氨酸蛋白酶，劃分為15個家族，屬木瓜蛋白酶同源酶類[1]。木質(zhì)部半胱氨酸蛋白酶2(XCP2)為半胱氨酸蛋白酶CA家族成員，是植物管狀細胞凋亡(PCD)過程中重要的自溶酶[2-3]?；谀静木哂兄匾慕?jīng)濟價值，早期對XCP蛋白酶的研究主要集中在植物調(diào)節(jié)木質(zhì)部分化、管狀分子PCD機制、次生壁及木質(zhì)素生物合成上，且研究成果較少[4-6]。但近期相關研究表明半胱氨酸蛋白酶在植物響應病害侵染中也具有重要作用[1]，其中較為典型的是番茄與枝孢菌(Cladosporiumfulvum)互作[7]，玉米與玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)親和互作[8]，再者是其參與本氏煙超敏反應抵抗多種病原細菌，如梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)[9]。作為調(diào)控植物抵抗活體營養(yǎng)型病原侵染的重要途徑，水楊酸(SA)信號轉導途徑能強烈誘導XCP蛋白表達，且滲透實驗表明該蛋白酶能誘導植物PR1基因表達[10]。Zhang等[11]通過突變體技術、酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術研究擬南芥與青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)互作，發(fā)現(xiàn)該病菌可通過與擬南芥PRN2蛋白互作，抑制擬南芥XCP2蛋白降解，使擬南芥易受青枯病菌侵染?？梢?，木質(zhì)部半胱氨酸蛋白酶為植物與病原物互作中重要的蛋白，而目前在水稻抗性基因的研究中對該基因的研究鮮有報到，僅嚴秀蕊等[12]進行過相關研究，對XCP2蛋白在水稻與病原物互作中的作用進行闡述，可為開發(fā)利用水稻半胱氨酸蛋白酶類抗病資源奠定基礎。

本實驗室利用水稻潛根線蟲侵染抗感品種而獲得具有表達量明顯上調(diào)的OsXCP2基因，為進一步研究其相關的功能，本研究將“酶切-連接”克隆技術與Gateway技術相結合構建了水稻OsXCP2基因過表達載體和RNAi載體，為后續(xù)探究該基因在水稻與病原物互作中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用水稻樣品采自本實驗室室內(nèi)種植的R155(霸王鞭)水稻根部組織；質(zhì)粒提取試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌DH5a、pEASY-T3克隆載體購自北京全式金公司；植物過表達載體pCAMBIA1302(含mGFP5、his tags)、Gateway入門載體pGWc和植物RNAi載體pB7GWIWG2(II)由中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所范成明老師惠贈。植物RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司、LR重組酶購自invitrogen公司；T4DNA 連接酶、rTaq酶、反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；KOD-plus-NEO高保真酶、限制性內(nèi)切酶BglII、SpeI、Eam1105 I購自NEB(北京)。

1.2 試驗方法

1.2.1OsXCP2基因orf克隆 參照植物RNA提取試劑盒操作說明從水稻根部組織中提取總RNA。以oligo(dT)n為引物，在AMV反轉錄酶作用下合成cDNA第一條鏈。將本實驗室水稻轉錄組測序得到OsXCP2基因EST序列提交至水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)進行blast，獲得OsXCP2開放閱讀框(orf)序列信息，根據(jù)該orf序列設計特異性引物XCP2-F/R。采用25 μL PCR反應體系進行擴增，PCR組分如下：2.5 μL 10×PCRKOD-plus-NEO高保真酶用緩沖液、2.5 μL dNTP (2 mmol/L)、 1.5 μL MgSO4(25 mmol/L)、2 μL 反轉錄產(chǎn)物、引物XCP2-F/R(10 mmol/L)各0.5 μL、1 μLKOD-plus-NEO高保真酶(5 U/μL)、加ddH2O至25 μL；PCR擴增條件如下：94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，68 ℃孵育10 min，除退火溫度有所變化，下文PCR擴增體系均參照上述體系進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，參考膠回收試劑盒說明書進行純化回收。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T3載體后，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，以M13通用引物進行菌落PCR鑒定，鑒定出的陽性克隆送蘇州泓訊公司測序,抽提測序正確的重組質(zhì)粒T3:XCP2，并于-80 ℃保存菌株。

1.2.2 植物過表達載體構建 用OsXCP2基因特異性引物XCP2O-F/R(兩端帶有限制性酶切位點BglII和SpeI)進行PCR擴增；用限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI酶切PCR產(chǎn)物與植物過表達載體pCAMBIA1302，酶切體系如下：5 μL 10×NEB 3.1 buffer、10 μL PCR產(chǎn)物/pCAMBIA1302載體、BglII、SpeI各1 μL、加ddH2O至50 μL,37 ℃酶切過夜后，分別膠回收酶切產(chǎn)物。IMPLEN微量核算分析儀檢測回收產(chǎn)物濃度后，調(diào)整目的片段與線性化載體的濃度為3∶1。參照T4DNA連接酶說明書連接目的基因與pCAMBIA1302載體，利用凍融法將連接產(chǎn)物轉化進入感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，用特異性引物pCA-F/R進行菌落PCR鑒定，擴繁并抽提陽性質(zhì)粒，用BglII和SpeI進行雙酶切鑒定，體系參照上文酶切體系。鑒定為陽性的克隆測序驗證，抽提測序正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA1302:XCP2，并于-80 ℃保存菌株。

1.2.3 植物RNAi載體構建 提交OsXCP2序列至NCBI進行Blast，獲該基因特異性序列，根據(jù)該序列設計特異性引物Ri-F/R，以T3:XCP2質(zhì)粒為模板，用該引物進行PCR擴增，回收純化擴增產(chǎn)物與Eam1105 I酶切處理的入門載體pGWc，利用T4DNA連接酶將OsXCP2基因的RNAi片段與酶切后的pGWc連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌后，用M13通用引物進行菌落PCR鑒定和測序。參展質(zhì)粒提取試劑盒說明抽提陽性重組質(zhì)粒pGWc:XCP2與pB7GWIWG2(II)質(zhì)粒；參照invitrogen LR重組酶操作說明配制反應體系后，于25 ℃進行LR重組反應。重組產(chǎn)物轉化進入感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂布于含50 mg/L Spe(壯觀霉素)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，將根據(jù)35 s啟動子與終止子序列設計的特異性引物FX-F/R與Ri-R組合使用，鑒定靶片段插入方向，抽提靶片段以反向重復方式插入的陽性克隆質(zhì)粒，送上海祥音公司測序，測序正確的克隆命名為pB7GWIWG2:XCP2，菌株-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌GV3101 參展細菌感受態(tài)細胞制備方法制備土壤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，利用凍融法將2種重組質(zhì)粒導入感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101中，分別在含50 mg/L Rif(利福平)和50 mg/L Kan(卡那霉素)的YEP平板與含50 mg/L Rif、50 mg/L Spe(壯觀霉素)的YEP平板上28 ℃培養(yǎng)36～48 h，以特異性引物pCA-F/R和Ri-F/R分別進行菌落PCR鑒定，鑒定出的陽性克隆用30%甘油保存在-80 ℃冰箱備用。

表2 PCR擴增所用引物

2 結果與分析

2.1 OsXCP2基因過表達載體構建

用含BglII和SpeI酶切位點的特異性引物擴增T3:XCP2質(zhì)粒獲得大小為1 100 bp左右的OsXCP2 cds序列(兩端含酶切位點)；用T4DNA連接酶將酶切純化后cds片段與植物過表達載體pCAMBIA1302進行連接，利用凍融法將連接產(chǎn)物轉化進入感受態(tài)大腸桿菌DH5a，用pCA-F/R進行菌落PCR鑒定陽性克隆，PCR產(chǎn)物約2 490 bp，與預計一致。擴繁陽性克隆后抽提重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI進行雙酶切鑒定，預計產(chǎn)生1個10 550 bp大小片段和1個1 100 bp大小片段，與電泳結果一致(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒示意Fig.1 The structure of recombinant plasmids

M：marker DL 15000；1： pCAMBIA302載體；2：雙酶切產(chǎn)物；3： 基因cds序列M:DNA marker DL15000;1:pCAMBIA1302 vector;2:enzyme digest;3:XCP2 CDS fragment圖2 重組過表達質(zhì)粒雙酶切鑒定 Fig.2 Double enzyme digesting of recombinant overexpression plasmid

M：marker DL 2000；1：Ri-F/R擴增結果；2：FX-F/Ri-R擴增結果；3:FX-R/Ri-R擴增結果M:molecular marker of DL 2000;1,2,3:PCR assay used by primer Ri-F/R,FX-F/Ri-R,FX-R/Ri-R圖3 重組RNAi PCR鑒定Fig.3 PCR assay of recombinant RNAi plasmid

2.2 OsXCP2基因RNAi載體構建

利用OsXCP2 RNAi片段特異性引物與限制性內(nèi)切酶Eam1105 I以T3:XCP2質(zhì)粒為模板，將RNAi靶片段克隆進入Gateway入門載體pGWc后，在LR重組酶作用下將靶片段通過位點特異性重組反向重復插入到植物RNAi載體pB7GWIWG2中，以引物FX-F/Ri-R、FX-R/Ri-R、Ri-F/R進行菌落PCR鑒定(圖3)，并對鑒定出的陽性克隆進行測序，結果顯示靶片段成功重組到該RNAi載體中。

M：marker DL 5000；2、11：陽性克隆M:molecular marker of DL 5000; 2、11：positive clones圖4 重組過表達質(zhì)粒轉化GV3101鑒定Fig.4 PCR assay of recombinant overexpression plasmid transforming into GV3101

M：marker DL 2000；除10外均為陽性克隆M:molecular marker of DL 2000;Execept 10:positive clone圖5 重組RNAi質(zhì)粒轉化GV3101鑒定Fig.5 PCR assay of recombinant RNAi plasmid transforming into GV3101

2.3 重組質(zhì)粒轉化GV3101

參照質(zhì)粒提取試劑盒抽提兩種重組質(zhì)粒，利用凍融法將其轉化進入感受態(tài)土壤農(nóng)桿菌GV3101，分別用特異性引物pCA-F/R、Ri-F/R進行菌落PCR鑒定。電泳結果(圖4、5)與預計的2 490 bp和450 bp。表明重組質(zhì)粒已成功轉化入土壤農(nóng)桿菌GV3101。

3 結論與討論

本試驗首先利用特異性引物獲得該基因兩端含BglII和SpeI酶切位點的編碼區(qū)序列，然后在2種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶作用下將目的片段重組進入植物表達載體pCAMBIA1302(含GFP、his tags)。再者，在NCBI中比對獲得該基因特異性序列信息，并設計引物獲得該序列。由于未在該序列中添加用于BP重組反應的特異性位點，先利用內(nèi)切酶Eam1105 I將該片段重組到入門載體pGWc中，再進行LR重組反應獲得重組質(zhì)粒pB7GWIWG2:XCP2。由于pGWc載體中AhdI酶切位點經(jīng)酶切后產(chǎn)生的平末端難以進行連接，選用其同尾酶Eam1105 I進行切割，連接反應相對容易進行。

早期對XCP編碼基因的研究主要集中在植物細胞分化及細胞凋亡，雖然近期對其在植物抗病機制中的作用進行了闡述，但局限于玉米，番茄、擬南芥等，對其在水稻與病原互作中的作用并無相關報道。水稻作為重要的糧食作物，病原物的侵染不僅會導致水稻產(chǎn)量下降，也會引起水稻細胞程序性死亡，如潛根線蟲的侵染[13]。因屬活體營養(yǎng)型的潛根線蟲不導致水稻細胞凋亡，水稻的這種細胞凋亡被認為是水稻的自我保護機制之一。水楊酸(SA)信號轉導途徑在水稻抵抗病原侵染中發(fā)揮重要作用[14-15]，早期對玉米XCP2的研究表明SA信號途徑可通過與其作用誘導植物防衛(wèi)反應[9-10]，同時對擬南芥XCP2的研究表明青枯病菌可以通抑制XCP2的降解使水稻易受該病菌侵染[11]，此雖說明XCP2在植物與病原物互作中發(fā)揮重要作用，但目前水稻中關于該基因的報道甚少，對其具體作用機制和在水稻與病原物互作中的作用了解不足。構建水稻OsXCP2基因植物表達載體(含GFP、his tag)和RNAi載體為后續(xù)進行該基因亞細胞定位、互作蛋白研究、轉基因水稻株系獲取提供條件，可進一步闡明半胱氨酸蛋白酶在植物細胞凋亡、組織分化及在水稻抗病中的作用。

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