單睿陽，陳常頌，鐘秋生，林鄭和，陳志輝，游小妹

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015)

植物細胞色素P450(簡稱P450，Cyt P450)是一類含有血紅素和疏基的氧化酶系，該酶系能與植物細胞內(nèi)的質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器膜結(jié)合且具有復雜的生物學功能，因而近年來成為學術(shù)界的研究熱點[1]。植物P450基因的命名一般以氨基酸序列的相似性作為依據(jù)，把同源性大于40%劃歸為同一家族成員，把同源性大于55%的視為同一家族的另一亞家族成員。隨著轉(zhuǎn)錄組測序的發(fā)展，越來越多的植物P450被鑒定出來，目前已在擬南芥、玉米、大豆、水稻、番茄和蓖麻等模式農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了大量P450基因[2]。

P450在植物體中擔當著重要的生物學功能，按照前人的研究結(jié)果，這些功能大致可分為2類，第一類是具有代謝解毒功能，它可催化一些外來物質(zhì)的降解，使植物對一些除草劑、殺蟲劑和環(huán)境毒物等產(chǎn)生抗性。例如水稻能通過P450的脫甲基(demethylation)作用降解芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl，BSM)[3]。小麥能通過P450的環(huán)甲基羥基化作用(cyclomethylhydroxylation)降解綠麥隆(chlortoluron)[4]；第二類是能催化植物體的一些內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為次生代謝產(chǎn)物，使植物抵抗一些外源性物質(zhì)如昆蟲、細菌的侵擾，增強植物的逆境生存能力。如植物P450在生物堿(alkaloid)、萜類(terpene)、植物激素類(phytohormone)、木質(zhì)素(lignin)和黃酮類(flavonoid)等的生物合成中起到重要的催化作用，這些物質(zhì)在植物抗蟲、抗病過程中起到重要的作用[5]。

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，而選育具有抗蟲、抗病性強的茶樹新品種是育種工作者的重要目標之一，因此深入挖掘并研究茶樹P450的功能對今后茶樹的育種工作具有重要的指導意義?；诖?，本研究從NCBI中下載獲得了茶樹全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(Taxonomy ID：4442)，從該數(shù)據(jù)庫中選取了茶樹CYP710A1的基因片段，采用RT-PCR技術(shù)對該基因片段進行了堿基校正，并通過RACE技術(shù)獲得了基因全長。通過相關(guān)分子生物學分析軟件，分析了該基因的氨基酸結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹及蛋白功能域。最后，通過qRT-PCR技術(shù)檢測了該基因在茶樹不同葉片中的表達特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要試劑

本研究以常規(guī)品種鐵觀音為試驗材料，采樣部位為單芽、一葉、二葉、三葉、四葉、五葉。樣品采摘于福安市社口鎮(zhèn)福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所2號山品種園(東經(jīng)119°32′11″～119°38′之間，北緯27°8′～27°13′40″)。構(gòu)建cDNA模板所用的植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure plant kit (dp441)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit(With gDNase)購于Invitrogen公司；cDNA全長克隆所用的SMARTer?RACE 5′/3′Kit試劑盒以及熒光定量所用的FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)試劑盒購于TaKaRa公司；普通分子試劑Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNase/RNase Free Water、DL2000 Marker及T4 DNA連接酶等均購于根生化科技(北京)有限公司。

1.2 總RNA提取及cDNA模板的合成

長勢良好、葉片生長均勻的鐵觀音一芽一葉，用液氮冷凍后將其研磨成粉，參照植物總RNA提取試劑盒說明書，提取鐵觀音的總RNA，使用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測所提取RNA的完整性，再用NanoDrop 2000分光光度計檢測其純度。最后，通過RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以提取的RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄成克隆所用的cDNA模板。

1.3 茶樹CYP710A1基因的中間片段克隆

在NCBI的物種分類學數(shù)據(jù)庫中找到茶樹的轉(zhuǎn)錄組基因信息(Taxonomy ID：4442)，通過下載獲得了已登入的茶樹轉(zhuǎn)錄組mRNA。分析發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄組共有34萬多條不完整mRNA信息，但無完整的基因序列命名。本研究通過建立本地Blast數(shù)據(jù)庫(方法參照華大基因“windows系統(tǒng)下本地Blast的實現(xiàn)”)，在windows系統(tǒng)下重新建立單機版的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過比對分析獲得茶樹CYP710A1基因的序列片段。

根據(jù)已有的茶樹CYP71A26序列信息，通過Primer 5.0軟件設計一對簡并引物710A1-F1/R1(表1)，并以已構(gòu)建的茶樹cDNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)進行擴增。RT-PCR反應程序為：94℃總變性3 min；94℃預變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸1.5 min，共33個循環(huán)；最后，72℃延伸15 min后，4℃保存?zhèn)溆?。緊接著，將目的條帶進行雙酶切與載體pMD19-T進行連接，并進行轉(zhuǎn)化、藍白斑挑選后送往測序公司(上海鉑尚生物技術(shù)有限公司)委托測序。

1.4 茶樹CYP710A1基因的5′及3′ RACE擴增

獲得茶樹CYP710A1的中間序列后，在頭部5′端設計一對特異性引物710A1-R2-outer與710A1-R3-inner(表1)進行5′ RACE擴增。緊接著，在尾部3′端設計另外一對特異性引物710A1-F2-outer與710A1-F3-inner(表1)進行3′ RACE擴增。5′與3′RACE反應程序參照步驟1.3。最后，使用DNAstar 8.0軟件，將三段序列的重復序列去除，并拼接獲得茶樹CYP710A1的全長序列。

1.5 茶樹CYP710A1基因的生物信息學分析

茶樹CYP710A1基因的氨基酸結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白功能域及系統(tǒng)進化樹的分析方法及分析的網(wǎng)站參見單睿陽等[2]。

1.6 茶樹CYP710A1基因的表達檢測

試驗茶樣取自于長勢良好、葉片生長均勻的鐵觀音茶園，并于新梢的芽頭、一芽1～5葉共6個葉外分別取樣，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒄詹襟E1.2，將所取樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，用于檢測茶樹CYP710A1基因在不同葉片中的表達含量。根據(jù)已獲得的茶樹CYP710A1基因全長，采用Primer 5.0軟件設計一對特異性的熒光定量引物710A1-F4/R4(表1)及一對熒光定量引物GAPDH-F1/R1(表1)，參照熒光定量試劑盒的操作步驟，配制每樣20 μL的總反應體系：正反引物各1.0 μL；樣品cDNA 1.0 μL；SYBR Green 10.0 μL；最后補ddH2O 7.0 μL。qRT-PCR 反應程序為：95℃總變性30s；95℃預變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，共33個循環(huán)；最后，采用比較CT的計算方法(2-ΔΔCT)計算茶樹CYP710A1基因在不同葉片中的表達含量。

表1 設計的引物

注：表中的F為基因的正向引物，R為基因的反向引物，inner為基因的內(nèi)引物，outer為基因的外引物。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

qRT-PCR每組樣品設3個重復，并采用means±SE取均值的計算方法，對每組數(shù)據(jù)于Microsoft Office Excel軟件中進行作圖，差異性顯著分析由SPSS 13.0軟件中的鄧肯氏(Duncan’s multiple range test)單因素方差(one-way ANOVA)方法分析完成(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CYP710A1基因的全長克隆

首先，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得了1 022 bp(圖1-條帶2)的CYP710A1中間序列。然后，通過5′ RACE技術(shù)克隆得了281 bp(圖1-條帶1)的CYP710A1頭部序列，通過3′ RACE技術(shù)克隆得了610 bp(圖1-條帶3)的尾部序列。最后，拼接得到1 911 bp的CYP710A1基因全長。

2.2 茶樹CYP710A1基因的生物信息學分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 通過ProtParam網(wǎng)站對CYP710A1基因全長進行了分析，結(jié)果表明CYP710A1含有1 506 bp的編碼序列(ORF)，能夠編碼501個氨基酸(圖2)，所編碼蛋白的分子式為C1772H2803N481O526S12，分子量大小為57.06 kDa，理論等電點為7.64，總的親水性平均系數(shù)-0.092。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析 在NCBI比對了茶樹CYP710A1基因的同源性，獲得了與該基因同源性較高的博落回Macleayacordata、蓮花Nelumbonucifera、胡桃Juglansregia、栓皮櫟Quercussuber、葡萄Vitisvinifera、黃花蒿Artemisiaannua、萵苣Lactucasativa、向日葵Helianthusannuus、風鈴椒Capsicumbaccatum和芝麻Sesamumindicum的CYP710A1基因序列。將以上10個基因序列與茶樹CYP710A1基因制成fasta格式文檔，導入至MEGA 4.0軟件中，利用鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)的1 000次多重比對方法，構(gòu)建了茶樹CYP710A1基因的系統(tǒng)進化樹(圖3)。從該進化樹可以看出，茶樹CYP710A1基因與風鈴椒C.baccatum親緣關(guān)系較近，而與博落回M.cordata親緣關(guān)系較遠。

圖1茶樹CYP710A1基因的全長克隆
Fig.1FulllengthofCYP710A1geneclonedfromC.sinensis
注：M1-M3條帶為DNA Marker 2000，1-3條帶分別
為CYP710A1基因的中間、頭部和尾部序列。

圖2 茶樹 CYP710A1基因編碼的氨基酸序列Fig.2 Sequence of ORF from CYP710A1 gene of C.sinensis

圖3 茶樹 CYP710A1基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CYP710A1 gene from C.sinensis 注：樹中左側(cè)包含的數(shù)字代表不同物種間親緣關(guān)系的遠近。

2.2.3 三級結(jié)構(gòu)預測 進一步分析了CYP710A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該模型主要由α螺旋和β折疊組成，該模型的GMQE(Global Model Quality Estimation，模型質(zhì)量估測)值為0.65(值越接近1，表明建模質(zhì)量越好)，表明模型可信度較高。

2.2.4 蛋白功能域及亞細胞定位分析 通過SMART網(wǎng)站，進一步分析了茶樹CYP710A1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域(functional domain structure)。結(jié)果表明，CYP710A1具有一個P450蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam domain)，位于編碼序列的第34～475(圖5-黑色部分)位點上。另外，蛋白含有一個由“WLTLAPYLFSLVLLLVLLEQIFY”組成的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane structure)(圖5-藍色部分)，位于編碼序列的第5～27位點上。

2.3 茶樹CYP71A26基因在不同葉片間的差異表達分析

研究了CYP710A1基因在不同葉片間的表達差異。結(jié)果表明，CYP710A1基因在芽頭的表達量最低，在一葉、二葉、三葉中的表達量依次升高，而后在四葉、五葉中的表達量依次回落。其中，在三葉中的最高表達量是芽頭的38.17倍。

圖4 茶樹 CYP710A1蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of CYP710A1 of C.sinensis

圖5 茶樹 CYP710A1的蛋白功能域Fig.5 Functional domain of CYP710A1 protein of C.sinensis注：圖下方的數(shù)字代表編碼的氨基酸順序。

圖6 茶樹CYP710A1基因的在不同葉片間的表達量Fig.6 Expression of CYP710A1 gene in leaves at different positions on a C.sinensis plant

3 討論與結(jié)論

本研究利用NCBI中的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了茶樹CYP710A1的部分片段。通過RT-PCR及RACE技術(shù)克隆了該基因的全長。該基因全長含有1 506 bp的編碼序列(ORF)，能夠編碼502個氨基酸，具有一段較長的P450蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam domain)，從而說明該基因為典型的茶樹P450基因。同時，該蛋白具有能與細胞膜結(jié)合的小段跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane structure)，與前人所闡述的P450多數(shù)為跨膜蛋白，且多數(shù)位于細胞內(nèi)的如質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器膜上相符[2]。

植物在自然生長過程中，不可避免的會受到外界病蟲害的侵擾，而P450在抵抗侵染過程中發(fā)揮著重要的作用[6]。如Wang等[7]研究表明，當蚜蟲Myzuspersicae為害煙草葉片后，煙草葉片中的腺毛能激發(fā)細胞色素P450(CYP51)的特異表達，從而提高對蚜蟲的抵抗能力。以及P450所催化的內(nèi)源性物質(zhì)代謝，能將苯丙烷類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成有毒的花椒毒素(xanthotoxin)，提高棉花對棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的抵抗能力[8]。郭蕭等[9]研究了取食茶樹不同成熟度葉片對茶尺蠖Ectropisoblique生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，嫩葉有利于茶尺蠖的生長，而老葉則不利于茶尺蠖種群的發(fā)生。本研究對CYP710A1在不同葉片的表達含量做了相應的檢測，結(jié)果表明CYP710A1基因在芽頭的表達量最低，在一葉、二葉、三葉中的表達量依次升高，而后在四葉、五葉中的表達量依次回落，這是否與不同成熟度的葉片對病蟲害具有不同的抵抗能力相關(guān)，后續(xù)仍需做進一步研究。