楊 軍，王讓劍，孔祥瑞，鄭國(guó)華，邱陳華

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹(shù)及烏龍茶加工科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，福建 福安 355015)

茶樹(shù)是山茶科山茶屬茶組的多年生常綠木本植物[1]，且為常異花授粉植物，具有高度雜合性，其遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜，種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀與加工品質(zhì)鑒定難度大、時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)與新品種選育工作造成較大的困難。近些年，EST-SSR來(lái)自于功能基因，具有多態(tài)性高、共顯性、技術(shù)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等特點(diǎn)[2-5]，在茶樹(shù)遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源鑒定篩選與輔助育種中廣泛應(yīng)用[6-9]。對(duì)茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析是野生茶樹(shù)種質(zhì)初步鑒定的重要手段。黃曉霞等[10]的研究結(jié)果說(shuō)明千家寨不同海拔梯度上野生茶樹(shù)居群遺傳多樣性隨著海拔梯度的遞增，居群的遺傳多樣性呈現(xiàn)出低-高-低的分布；毛娟等[11]發(fā)現(xiàn)樣本量在40個(gè)時(shí)，能較好地反映云南白鶯山地區(qū)茶樹(shù)資源的遺傳多樣性；張明澤等[12]認(rèn)為黔南野生茶樹(shù)資源間的遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬，具有豐富的遺傳多樣性。郭燕等[13]研究表明40個(gè)貴州古茶樹(shù)資源有較高的遺傳多樣性，主要是由遺傳因素和地理位置不同引起。周萌等[14]認(rèn)為樹(shù)齡3200年的香竹簧茶樹(shù)王與野生茶樹(shù)、栽培型茶樹(shù)品種之問(wèn)的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。姜曉輝等[15]研究表明廣東歷史名茶茶樹(shù)群體羅坑與馬圖群體間在過(guò)去的某個(gè)時(shí)間可能有過(guò)基因交流。茶樹(shù)種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析也有較多研究。王麗鴛等[16]認(rèn)為龍井群體的遺傳分化程度較低。姚明哲等[17]認(rèn)為江北茶區(qū)主要省份間茶樹(shù)種質(zhì)的遺傳分化程度低。喬婷婷等[18]認(rèn)為茶樹(shù)地方品種、選育品種(系)具有相對(duì)獨(dú)立的群體結(jié)構(gòu)，選育品種(系)根據(jù)親緣關(guān)系的不同形成不同的類群。吳曉梅等[19]認(rèn)為烏龍茶品種與綠茶品種間的遺傳結(jié)構(gòu)存在差異。本試驗(yàn)對(duì)福建省主要審(鑒)定品種、茶樹(shù)自然雜交后代群體、地方搜集資源群體進(jìn)行個(gè)體材料的親緣關(guān)系、遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析，以期為茶樹(shù)種質(zhì)初步鑒定與分子標(biāo)記輔助育種提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料來(lái)源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建省茶樹(shù)種質(zhì)資源及其自然雜交后代共94個(gè)(詳見(jiàn)表1)，采集各個(gè)材料一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-70℃冰箱中備用。

表1 94份供試材料的名稱與來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法[20]提取茶樹(shù)基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行茶樹(shù)基因組分子量大小檢測(cè)，用756-MC型紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶樹(shù)基因組DNA的純度(OD260/280比值)。

1.2.2 引物合成 參照文獻(xiàn)[21]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見(jiàn)表2。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定 PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5U)，模板DNA 1μL。PCR反應(yīng)于美國(guó)ABI-9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，使模板DNA 充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標(biāo)記熒光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 使用Struture 2.3.4[22]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，先計(jì)算各材料歸屬第k亞群的概率Q值。使用混合模型K值從3設(shè)置到10模擬群體結(jié)構(gòu)，每一個(gè)K值重復(fù)5次。將MCMC迭代設(shè)為100000次，初始burn-in次數(shù)為100000。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用ABI公司的GeneMapper4.0軟件，選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增出的條帶記錄大小。運(yùn)用PopGen3.2軟件計(jì)算Shannon信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)。運(yùn)用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進(jìn)行聚類分析。

表2 17對(duì) SSR 引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 94個(gè)材料間親緣關(guān)系分析

從圖1上看出，白雞冠與其自然雜交后代4個(gè)聚類在一起，說(shuō)明白雞冠自然雜交后代遺傳組成主要來(lái)自于母本白雞冠，后代遺傳相對(duì)穩(wěn)定(i)；福云6號(hào)與其自然雜交后代分為2個(gè)類群，其中，第一類群B1、B2、B3與福云6號(hào)(B11)聚類在一起(ii)，B4、B5、B8、B10聚類在一起，推測(cè)B1、B2、B3與福云6號(hào)(B11)親緣關(guān)系較近；金牡丹(C11)及其所有自然雜交后代都聚類在一起(iii)，說(shuō)明其后代遺傳組成主要來(lái)自于母本金牡丹；金觀音(D11)與D2、D4、D5、D6、D8聚類在一起(iv)，推測(cè)其與母本金觀音親緣關(guān)系較近；9個(gè)材料紫玫瑰自然雜交后代聚類在一起(v)，卻沒(méi)有和親本(E11)聚類在一起，推測(cè)父本為同一類型材料，且遺傳組成主要來(lái)自于父本；7個(gè)悅茗香自然雜交后代與悅茗香(F11)聚類在一起(vi)，說(shuō)明其后代遺傳成分主要來(lái)自于母本悅茗香；武夷山種質(zhì)資源G1、G3、G4、G6、G10、H1、H2、H3、H10、與肉桂聚類在一起(vii)，推測(cè)與肉桂親緣關(guān)系較近；武夷山地方資源G5、H6、H8、H5、H11與大葉烏龍(L2)、梅占(L5)、矮腳烏龍(L8)、白芽奇蘭(L10)聚類在一起(viii)，武夷山種質(zhì)資源與這些品種遺傳組成較為相似；武夷山種質(zhì)資源H7與所有參試材料都沒(méi)有聚類在一起，說(shuō)明H7遺傳組成相對(duì)特殊。

2.2 群體間遺傳多樣性比較與親緣關(guān)系分析

從表3中看出，Shannon遺傳多樣性指數(shù)最高的為群體7、群體8(武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源)，且高于群體9(福建省茶樹(shù)品種)；6個(gè)自然雜交后代群體遺傳多樣性指數(shù)最高的是福云6號(hào)自然雜交后代，推測(cè)是由于母本福云6號(hào)有云南茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)，遺傳多樣性相對(duì)廣泛；白雞冠、悅茗香、紫玫瑰的自然雜交后代群體遺傳多樣性相當(dāng)，略高于金觀音、金牡丹的遺傳多樣性指數(shù)。

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D主要反映Ho(觀測(cè)雜合度)和He(期望雜合度)之間的平衡關(guān)系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，D值大于0說(shuō)明存在雜合子過(guò)剩，D值小于0，說(shuō)明存在雜合子缺失現(xiàn)象[23]。從表3可以看出，6個(gè)自然雜交后代群體Ho高于對(duì)應(yīng)的He，D值大于0，屬于親本單一，雜合子過(guò)?，F(xiàn)象；武夷山2個(gè)地方種質(zhì)資源群體Ho低于對(duì)應(yīng)He，D值小于0，屬于試驗(yàn)材料有限雜合子缺失現(xiàn)象。

從群體聚類圖2看出，群體1、群體6、群體7與群體8聚類在一起，說(shuō)明這4個(gè)群體親緣關(guān)系相對(duì)較近，悅茗香自然雜交后代群體的父本可能來(lái)自于閩北武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源；群體2、群體9、群體3與群體4聚類在一起，推測(cè)福云6號(hào)自然雜交后代群體的父本可能來(lái)自于閩南鐵觀音、黃棪等高香茶樹(shù)種質(zhì)資源。

2.3 94個(gè)材料群體結(jié)構(gòu)分析

采用Struture 2.3.4軟件對(duì)94個(gè)茶樹(shù)品種(系)進(jìn)行系統(tǒng)解析，當(dāng)K=3時(shí)△K值為最大值，從圖3中看出，94個(gè)茶樹(shù)品種(系)分為3個(gè)類群。參考劉志齋[24]等以類群屬性比率50%為標(biāo)準(zhǔn)的劃分依據(jù)，94個(gè)茶樹(shù)品種(系)分為S1、S2、S3類群，S1類群從品種來(lái)源看，代表性材料為黃棪、鐵觀音，主要材料為金觀音及其自然雜交后代、金牡丹及其自然雜交后代，體現(xiàn)的是黃棪、鐵觀音等閩南高香資源類群屬性；S2類群從品種來(lái)源看，代表性材料為白雞冠、福云6號(hào)、福鼎大白茶、悅茗香，主要材料為白雞冠、福云6號(hào)、紫玫瑰與悅茗香自然雜交后代，體現(xiàn)的是烏龍茶與綠茶資源的混合類群屬性；S3類群從品種來(lái)源看，代表性材料為肉桂、矮腳烏龍，主要材料為武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源，體現(xiàn)閩北優(yōu)異烏龍茶種質(zhì)資源屬性(詳見(jiàn)表4)。

表3 9個(gè)群體遺傳多樣性

圖2 群體遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig.2 Dendrogram on genetic similarities of groups

圖3 假設(shè)K=3時(shí)群體按照所估計(jì)的成分(Q)值的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Membership coefficients of 3 clusters based on assumption of cluster number (k=3) and accessions sorted by individuals

表4 94個(gè)材料的群體結(jié)構(gòu)

(續(xù)表4)

第一類群鐵觀音、黃棪第二類群白雞冠、福云6號(hào)、福鼎大白茶、悅茗香第三類群肉桂、矮腳烏龍代號(hào)組成1組成2組成3代號(hào)組成1組成2組成3代號(hào)組成1組成2組成3C90.98540.00760.007B70.38050.57460.045H100.01010.010.9799D10.57590.41090.0131B80.40320.59020.007H110.0070.01150.9815D110.95390.03470.0114D100.36220.55420.084H20.02610.01550.9584D20.98650.00750.006E10.15740.80540.037H30.0080.01040.9816D30.98530.00790.0069E100.04040.94590.014H40.01250.08860.8989D40.98550.00850.006E20.05540.93090.014H50.01480.01790.9674D50.98550.00840.0061E30.17420.56510.261H60.01140.01590.9727D60.97340.01820.0084E40.15630.82420.02H70.0120.04350.9445D70.98460.00930.0061E50.15710.83070.012H80.0070.01420.9788D80.98590.0080.0061E60.17270.80780.02H90.00930.15720.8335D90.9840.00910.0069E70.05210.92940.019L100.46150.02040.5181E110.68540.18570.1289E80.33910.64090.02L20.11750.18890.6937F70.58810.24860.1633E90.03440.95540.01L90.14610.34850.5054L110.76330.19550.0412F10.02180.83820.14L80.46680.02560.5076L30.58060.30430.1151F100.0070.92750.066平均值0.057290.04560.8971074L40.94260.03360.0237F110.01250.70370.284L50.53790.1320.3301F20.0110.96440.025平均值0.87040.0770930.0525F40.00990.9790.011F50.01190.96450.024F60.0080.91490.077F80.0190.95090.03F90.03080.9430.026L10.01650.89940.084L60.01050.93980.05平均值0.11820.8360.05

3 討論

3.1 武夷山種質(zhì)資源初步鑒定

武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源豐富，據(jù)歷史記載有1187種，其中鐵羅漢、水金龜、白雞冠、半天妖等四大名樅就是從武夷山的菜茶中選出[25]，武夷菜茶在世界茶樹(shù)植物學(xué)分類學(xué)上占有重要地位，被稱為武夷種、武夷亞種或武夷變種[26]。劉振[27]、朱晨[28]、姜燕華[29]分別對(duì)福建茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，Shannon多樣性指數(shù)平均值分別為1.16、0.368、0.877，本試驗(yàn)中2個(gè)武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源群體的Shannon多樣性指數(shù)平均值分別為1.219、1.136，參試武夷山茶樹(shù)種質(zhì)資源群體遺傳多態(tài)性相對(duì)最豐富；武夷山種質(zhì)資源2個(gè)群體間沒(méi)有明顯的差異性，群體親緣關(guān)系較近；22個(gè)資源主要分為2個(gè)類型，第1個(gè)類型9個(gè)材料與肉桂親緣關(guān)系較近，第2個(gè)類型5個(gè)材料與大葉烏龍(L2)、梅占(L5)、矮腳烏龍(L8)、白芽奇蘭(L10)構(gòu)成的小群體聚類在一起，遺傳組成較相似；其中，武夷山種質(zhì)資源H7與所有參試材料都未聚類在一起，推測(cè)參試材料H7遺傳基礎(chǔ)較為特殊，需進(jìn)一步觀察與試驗(yàn)。

3.2 6個(gè)自然雜交后代初步鑒定

白雞冠自然雜交后代遺傳基礎(chǔ)與白雞冠多相一致；紫玫瑰自然雜交后代未與紫玫瑰聚類在一起，推測(cè)其遺傳基礎(chǔ)受父本影響較大；悅茗香自然雜交后代遺傳組成與悅茗香一致，群體與武夷山地方資源親緣關(guān)系較為接近，推測(cè)悅茗香自然雜交后代的父本是武夷山種質(zhì)資源類型；福云6號(hào)自然雜交后代分為2種類型，第1個(gè)類型3個(gè)材料與福云6號(hào)聚類在一起，遺傳組成偏向綠茶，另外6個(gè)材料與鐵觀音、黃棪等高香烏龍茶品種聚類在一起，推測(cè)其父本為鐵觀音、黃棪等高香烏龍茶品種資源；金觀音、金牡丹及自然雜交后代與鐵觀音、黃棪屬于1個(gè)類型。