王定鋒，李良德，李慧玲，張 輝，王慶森，吳光遠(yuǎn)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

綠僵菌Metarhiziumspp.是絲孢類(lèi)生防真菌的典型代表，其寄主包含8目30科200多種昆蟲(chóng)、螨類(lèi)及線蟲(chóng)，已被用于防治多種農(nóng)林害蟲(chóng)[1-2]。綠僵菌是一個(gè)復(fù)合種，雖然Tulloch[3]和Rombach 等[4]依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將綠僵菌分為金龜子綠僵菌M.anisopliae、平沙綠僵菌M.pinghaense(即M.pingshaense)、大孢綠僵菌M.majus、黃綠綠僵菌M.flavoviride、黃綠綠僵菌小孢變種M.flavoviridevar.minus，但該分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)還是不時(shí)的受到其他研究者的質(zhì)疑。近年來(lái)，真菌分子分類(lèi)系統(tǒng)正受到越來(lái)越多研究者的青睞。Driver 等[5]通過(guò)對(duì)綠僵菌核糖體ITS和28S rDNA D3 區(qū)的序列分析，較好地區(qū)分了綠僵菌屬內(nèi)種和變種水平的鑒別難題。Bischoff 等[6-7]分析了EF-1α、RPB1、RPB2 和β-tubulin 等4個(gè)核基因序列，并結(jié)合部分菌株產(chǎn)孢形態(tài)學(xué)特征，獲得了更合理的綠僵菌分類(lèi)系統(tǒng)，且得到了同行研究者的普遍認(rèn)可。

蠐螬屬昆蟲(chóng)綱鞘翅目(Coleoptera)金龜子科(Scarabaeidae)幼蟲(chóng)的總稱，是地下害蟲(chóng)中最重要的類(lèi)群，其具有分布最廣、食性雜、防治難等特點(diǎn)[8-9]。茶園常見(jiàn)的蠐螬有銅綠麗金龜(AnomalacorpulentaMotschulsky)、東北大黑鰓金龜(HolotrichiadiomphaliaBates.)、黑絨金龜甲(SericaorientalisMotschulsky)等3種。在茶園，這三種蠐螬幼蟲(chóng)可單獨(dú)或混合發(fā)生，主要為害茶苗根部，嚴(yán)重時(shí)常咬斷茶樹(shù)幼苗的主根或側(cè)根，1～3年生幼齡茶苗也常受害，造成新植茶園缺莢斷行或成片缺苗。目前，蠐螬主要還是以化學(xué)防治為主，但由此引發(fā)的農(nóng)藥3R問(wèn)題日益突出，有必要探索安全、高效、可持續(xù)的新手段來(lái)防治該類(lèi)害蟲(chóng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)生真菌對(duì)蠐螬具有很好的生防潛力。尹炯[10]等發(fā)現(xiàn)布氏白僵菌粉劑與殺蟲(chóng)雙顆粒劑混合施用對(duì)甘蔗蠐螬具有較好的防治效果。申劍飛[11]等利用分子鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定方法，鑒定出平沙綠僵菌M.pingshaense(CQM132)和貴州綠僵菌M.guizhouense(CQM135)的基礎(chǔ)上，測(cè)試了兩個(gè)菌株對(duì)銅綠麗金龜和暗黑腮金龜幼蟲(chóng)(蠐螬)的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)菌株對(duì)兩種蠐螬幼蟲(chóng)都具有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)毒力。謝寧等[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤含綠僵菌CQMa128乳粉劑達(dá)每克1.0×108孢子時(shí)，其對(duì)蠐螬死亡率可達(dá)90%以上，LT90為10.5d。本研究通過(guò)對(duì)綠僵菌3個(gè)標(biāo)記基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建對(duì)分離自蠐螬僵蟲(chóng)的一株綠僵菌Ma1518菌株進(jìn)行了分子鑒定，明確了其為平沙綠僵菌M.pingshaense。本研究結(jié)果將為今后更好地利用該菌防治茶園蠐螬及其它鞘翅目害蟲(chóng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株：綠僵菌Ma1518菌株分離自茶園土壤中挖掘到的自然羅病死亡的蠐螬，并用薩氏培養(yǎng)基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract(SDAY)試管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基(SDAY)：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%瓊脂，pH 7.0。高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

SDY培養(yǎng)基為SDAY的液體形式，除了不添加瓊脂，其它成份、比例和滅菌條件同SDAY培養(yǎng)基。

1.3 綠僵菌基因組DNA提取

把綠僵菌孢懸液(1.0×106孢子·mL-1)接種到裝有10 mL SDY 培養(yǎng)基的三角瓶(30 mL)中，于25℃，150 rpm·min-1，搖床搖4 d后刮取三角瓶?jī)?nèi)壁的菌絲體。直接參照Raeder和Broda的方法[13]，提取綠僵菌菌絲的基因組DNA?；蚪MDNA提取后，用儀器檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，并保存于-20℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

以綠僵菌Ma1518基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS5 /ITS4[14]PCR擴(kuò)增菌株rDNA-ITS序列；采用Pbeta-F/ Pbeta-R和PRPB2-F/ PRPB2-R[15]引物分別擴(kuò)增菌株β-tubulin和RPB2序列。引物序列見(jiàn)表1。rDNA-ITS序列、β-tubulin序列和RPB2序列的PCR反應(yīng)體系都為：2×TaqMix 10 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物(10 mmoL)各1 μL，ddH2O 12 μL，總共25 μL。三個(gè)序列的PCR反應(yīng)程序都為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s；70℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；70℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收純化，送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。分別將rDNA-ITS序列、β-tubulin序列和RPB2序列測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blastn程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與在GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性分析。下載常見(jiàn)近緣種的相應(yīng)序列，以球孢白僵菌Beauveriabassiana相應(yīng)序列作為外源種，分別用MEGA4.0軟件ClustalX方法進(jìn)行多序列比對(duì)，并以鄰接法(neigbor-joining method)分別構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)[16]。

表1 菌株檢測(cè)的標(biāo)識(shí)序列引物

2 結(jié)果與分析

2.1 幾個(gè)標(biāo)記基因的擴(kuò)增結(jié)果

以ITS5/ITS4、Pbeta-F/ Pbeta-R和PRPB2-F/ PRPB2-R三對(duì)引物分別從綠僵菌Ma1518菌株基因組DNA中擴(kuò)增出1條約600 bp的ITS片段、1500 bp的β-tubulin片段和2000 bp的RPB2片段(圖1)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，ITS序列長(zhǎng)度為585 bp，菌株β-tubulin序列長(zhǎng)度為1231 bp，RPB2序列長(zhǎng)度為1893 bp。

2.2 綠僵菌Ma1518的分子鑒定

通過(guò)Blast與GenBank中已有的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，與Ma1518菌株的rDNA-ITS序列相似性達(dá)99%的大部分序列都是金龜子綠僵菌M.anisopliae和平沙綠僵菌M.pinghaense；為進(jìn)一步明確菌株Ma1518與幾種常見(jiàn)綠僵菌的親緣關(guān)系，分別選擇GenBank中已公布的金龜子綠僵菌M.anisopliae、平沙綠僵菌M.pinghaense、羅伯茨綠僵菌M.robertsii、貴州綠僵菌M.guizhouense和大孢綠僵菌M.majus等的rDNA-ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果表明，

圖1 菌株Ma1518幾個(gè)分子標(biāo)記片段的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product amplified from ITS region of Ma1518 isolates注：1：β-tubulin片段；2：空白；3：RPB2序列；4：ITS片段；5：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

綠僵菌Ma1518菌株的rDNA-ITS序列雖然與金龜子綠僵菌M.anisopliae聚集在一個(gè)最小的進(jìn)化分支上，但與平沙綠僵菌M.pinghaense也聚集在一個(gè)較小的分支上(Bootstrap值為75%)(圖2)。

在GenBank中與Ma1518菌株的beta-tubulin序列相似性達(dá)99%的大部分序列都是平沙綠僵菌M.pinghaense和羅伯茨綠僵菌M.robertsii；為進(jìn)一步明確菌株Ma1518與幾種常見(jiàn)綠僵菌的親緣關(guān)系，利用已在GenBank中公布的平沙綠僵菌M.pinghaense、金龜子綠僵菌M.anisopliae、羅伯茨綠僵菌M.robertsii、貴州綠僵菌M.guizhouense和大孢綠僵菌M.majus等的beta-tubulin序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，從圖3可以看出綠僵菌Ma1518菌株的beta-tubulin序列與平沙綠僵菌M.pinghaense聚集在一個(gè)最小的分支上(Bootstrap值為98%)。

Ma1518菌株的RPB2序列在GenBank中比對(duì)發(fā)現(xiàn)與平沙綠僵菌M.pinghaense、貴州綠僵菌M.guizhouense和大孢綠僵菌M.majus的大部分RPB2序列的相似性達(dá)90%以上；下載GenBank中已公布的平沙綠僵菌M.pinghaense、金龜子綠僵菌M.anisopliae、羅伯茨綠僵菌M.robertsii、貴州綠僵菌M.guizhouense和大孢綠僵菌M.majus等的RPB2序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果如圖4所示，綠僵菌Ma1518菌株的RPB2序列與平沙綠僵菌M.pinghaense聚集在一個(gè)最小的分支上(Bootstrap值為83%)(圖4)，具有較近的親緣關(guān)系。綜合3個(gè)標(biāo)記基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果，我們判定綠僵菌Ma1518為平沙綠僵菌M.pinghaense。

圖2 基于rDNA-ITS序列的Ma1518菌株及綠僵菌類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogeny of rDNA-ITS gene sequences of Ma1518 and Metarhizium注：末端標(biāo)記為rDNA-ITS序列Genbank上的登錄號(hào)+菌株拉丁文，下同。

圖 3 基于beta-tubulin序列的Ma1518菌株及綠僵菌類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogeny of β-tubulin gene sequences of Ma1518 and Metarhizium

圖4 基于RPB2序列的Ma1518菌株及綠僵菌類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogeny of RPB2 gene sequences of Ma1518 and Metarhizium

3 討論

自從1883年Sorokin以金龜子綠僵菌為模式種建立綠僵菌屬M(fèi)etarhizium以來(lái)，形態(tài)學(xué)特征作為早期的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)揮了重要的作用。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的日益擴(kuò)充，使得分子數(shù)據(jù)用于綠僵菌系統(tǒng)發(fā)育的研究成為一種高效便捷的方法。本研究應(yīng)用ITS5/ITS4、Pbeta-F/ Pbeta-R和PRPB2-F/ PRPB2-R三對(duì)引物擴(kuò)增綠僵菌Ma1518 ITS序列、β-tubulin序列和RPB2序列，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的條帶單一；測(cè)序結(jié)果也進(jìn)一步表明，這3對(duì)引物可以有效的擴(kuò)增出目的條帶，該結(jié)果與[15]利用4個(gè)分子標(biāo)記基因成功鑒定出幾個(gè)綠僵菌菌株分類(lèi)地位相一致。

應(yīng)用β-tubulin序列和RPB2序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)綠僵菌Ma1518與平沙綠僵菌M.pinghaense都聚集在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，具有較近的親緣關(guān)系。但用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)綠僵菌Ma1518與金龜子綠僵菌M.anisopliae和平沙綠僵菌M.pinghaense一起聚集在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，且Bootstrap值為75%。研究表明，Bootstrap值大于70%就相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的95%，一般75%以上認(rèn)為是可信的[17]。該結(jié)果與王峰等[15]發(fā)現(xiàn)ITS序列分類(lèi)效率優(yōu)于其它標(biāo)記基因不一致。我們認(rèn)為造成上述結(jié)果的原因很可能是綠僵菌屬M(fèi)etarhizium的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)了多次的修訂，前期的研究者將ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，可能當(dāng)時(shí)近緣種的鑒定還不夠明確，提交時(shí)籠統(tǒng)的把平沙綠僵菌M.pinghaense認(rèn)定為是金龜子綠僵菌M.anisopliae；而近年來(lái)研究者新提交的綠僵菌屬I(mǎi)TS序列往往機(jī)械的通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，把相似度高的幾個(gè)序列默認(rèn)為新提交序列的同種菌株。因此，我們認(rèn)為與綠僵菌Ma1518 ITS序列進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建中，與平沙綠僵菌M.pinghaense一起聚集在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上三個(gè)金龜子綠僵菌M.anisopliae應(yīng)該是平沙綠僵菌M.pinghaense。本研究也進(jìn)一步證明了同時(shí)利用多個(gè)分子標(biāo)記基因來(lái)進(jìn)行菌株鑒定有利于彌補(bǔ)單基因鑒定結(jié)果的不確定性，能夠取得更加準(zhǔn)確、合理的分類(lèi)結(jié)果。