楊昳津，林祥娜，夏永軍，王光強(qiáng)，俞劍燊，胡健，艾連中*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)2(上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093) 3(上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海，200120)

黃酒是我國(guó)傳統(tǒng)的釀造飲料酒，與啤酒、葡萄酒并列為世界“三大古酒”[1]。黃酒釀酒酵母的釀造性能直接影響黃酒釀造的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)[2-3]。但隨著發(fā)酵過(guò)程中乙醇的不斷積累，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和發(fā)酵產(chǎn)生抑制[4-6]。高濃度乙醇對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的毒害作用主要體現(xiàn)在改變細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞生理活動(dòng)。酵母為了生長(zhǎng)、生存和發(fā)酵會(huì)對(duì)乙醇的脅迫產(chǎn)生相對(duì)的應(yīng)激反應(yīng)，即乙醇耐受性[7]。

提高黃酒酵母的乙醇耐受性不但可以提高原料利用率和發(fā)酵速率，同時(shí)可以使發(fā)酵進(jìn)行得更為徹底，從而進(jìn)一步提高乙醇產(chǎn)量，提高黃酒釀造品質(zhì)[8-10]。在乙醇脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，不同的酵母表現(xiàn)出不同程度的乙醇耐受性，表明不同酵母對(duì)乙醇脅迫的應(yīng)答存在極大的差異[11-13]。釀酒酵母對(duì)乙醇脅迫的應(yīng)答及耐受機(jī)理一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)[14-18]，細(xì)胞中的許多組分與酵母的乙醇耐受特性密切相關(guān)，如影響細(xì)胞膜流動(dòng)性的磷脂脂肪酸和肌醇等[19]、與蛋白質(zhì)活性相關(guān)的氨基酸[20]、與質(zhì)膜兩側(cè)跨膜電勢(shì)運(yùn)輸相關(guān)的無(wú)機(jī)離子[21]、作為分子伴侶防止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的海藻糖[22]；并且細(xì)胞的許多基因也控制著酵母菌的乙醇耐受性[23-27]。而通過(guò)添加一些對(duì)應(yīng)的效應(yīng)物，如氨基酸、無(wú)機(jī)鹽離子、海藻糖等，若可以提高黃酒酵母的乙醇耐受性，則在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)中，可通過(guò)添加效應(yīng)物提高酵母的乙醇耐受性能進(jìn)而提高黃酒釀造的生產(chǎn)效率，為優(yōu)質(zhì)黃酒的釀造提供前提。

本課題通過(guò)乙醇定向馴化得到1株乙醇耐受性明顯提高的黃酒釀酒酵母單倍體菌株。為了維持酵母的優(yōu)良性狀，最好是培育純合二倍體菌株，因此，獲得優(yōu)良的單倍體不僅是性狀遺傳分析所必須，又可為育種作好親本的準(zhǔn)備。通過(guò)培養(yǎng)及發(fā)酵過(guò)程中添加不同濃度的脂肪酸、氨基酸、無(wú)機(jī)離子、海藻糖和肌醇，分析不同的外源添加物對(duì)定向馴化后黃酒酵母的乙醇耐受性及發(fā)酵性能的影響，該單倍體黃酒酵母可用于進(jìn)一步選育優(yōu)良的二倍體黃酒發(fā)酵菌種，良好的發(fā)酵菌種對(duì)優(yōu)質(zhì)黃酒的釀造具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母BR 20菌株，從黃酒發(fā)酵醪液中分離得到并保存于中國(guó)微生物保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC 9445。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑

生長(zhǎng)培養(yǎng)基(YPD)：葡萄糖 20 g/L, 蛋白胨 20 g/L，酵母粉10 g/L，20 g/L瓊脂；

發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO41 g/L, KH2PO42 g/L, (NH4)2SO43 g/L, 蛋白胨3.6 g/L, 酵母粉4 g/L, 葡萄糖80 g/L；

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，KCl 1.8 g/L，乙酸鈉8.2 g/L，酵母粉2.5 g/L，20 g/L瓊脂；

于121 ℃下滅菌15 min，冷卻后備用。

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、MgSO4、NaCl、KCl、無(wú)水乙醇、海藻糖、肌醇等，均為分析純?cè)噭?。蝸牛酶?gòu)于上海生工生物工程有限公司，碘化丙啶購(gòu)于上海詡圣生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；PB-10 普及型 pH 計(jì)，德國(guó) Sartorius 公司；Guava EasyCyte plus流式細(xì)胞儀，美國(guó)Merk Millipore公司；Bioscreen C MBR全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab 公司，ZQZY-BS8全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；V-1600 PC可分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單倍體的制備與分離

根據(jù)肖冬光[28]的方法，將釀酒酵母BR 20活化后接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后少量涂布于產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后涂片染色，觀察子囊孢子的形成率。待孢子大量生成時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水制成孢子懸液，并調(diào)整菌液的濃度為107CFU/mL，取1 mL菌液4 000 r/min離心10 min后收集菌體，加入1 mL 蝸牛酶(20 mg/mL)進(jìn)行懸浮，37 ℃水浴酶解4～8 h，酶解期間取樣觀察子囊壁的破壁情況。因酵母孢子比酵母細(xì)胞更耐熱，酶解液在58 ℃條件下處理10 min以致死酵母細(xì)胞，待溫度冷卻至室溫后離心收集孢子，后用Tris-Cl洗滌2次后進(jìn)行10-1～10-6稀釋后涂布于YPD平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待長(zhǎng)出菌落后，將獲得的疑為單倍體的菌株再次接入產(chǎn)孢培養(yǎng)基，7 d后染色觀察其生孢情況，如果不生孢，則可確認(rèn)為單倍體。同時(shí)將未經(jīng)熱處理的孢子液同時(shí)接種于生孢培養(yǎng)基上，作為對(duì)照。

1.3.2 子囊孢子的染色

取干凈載玻片1張，滴加少許蒸餾水，接種環(huán)取少許菌，涂片固定。滴加5%孔雀石綠染液，在火焰上方加熱3～5 min，冷卻，水洗；加95%酒精脫色20～30 s，水洗；滴加0.5%番紅水溶液復(fù)染1 min，水洗，干燥；在顯微鏡下觀察，酵母子囊孢子呈綠色，酵母細(xì)胞則為粉紅色。

1.3.3 單倍體黃酒酵母的乙醇定向馴化

對(duì)分離得到的單倍體菌株進(jìn)行乙醇的定向馴化，具體流程步驟見(jiàn)圖1。

圖1 單倍體黃酒酵母的乙醇定向馴化過(guò)程Fig.1 The redirect process of ethanol domestication in haploid Chinese rice wine yeast

1.3.4 乙醇馴化酵母株的倍型鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[29]，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸含量的測(cè)定。將活化后的酵母制成種子液后以2%的接種量接入50 mL的YPD培養(yǎng)基中，以200 r/min于28 ℃下培養(yǎng)12～16 h后，調(diào)整菌液的濃度為2×105CFU/mL，取1 mL菌液以12 000 r/min離心1 min后收集菌體細(xì)胞，加入1 mL常溫存放的PBS溶液重懸；加入4 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20 ℃中固定10 min；以12 000 r/min離心1 min收集細(xì)胞，除去乙醇；用1 mL的PBS緩沖液清洗1次，以12 000 r/min離心1 min收集細(xì)胞；加入5 mL室溫存放的PBS緩沖液重懸菌體，12 000 r/min離心1 min收集細(xì)胞，加入1 mL碘化丙啶染色液(3 μmol/L)，室溫孵育15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3.5 單倍體黃酒酵母的乙醇耐受能力

定向馴化所得菌株與其出發(fā)菌株活化后，以2%接種量分別接入含有乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%及20%的YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃下以全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀記錄其生長(zhǎng)情況。

活化后的單倍體酵母，接入液體YPD中培養(yǎng)12～16 h至對(duì)數(shù)期，調(diào)整OD600值為1.0后，制成菌懸液，加入無(wú)水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)為18%、19%、20%、21%和22%，振蕩均勻，培養(yǎng)12 h后，以初始的置于冰箱的菌懸液作為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)其生長(zhǎng)情況。另外，培養(yǎng)4 h后，每12 mL 菌懸液中加入1 mL 0.1 %堿性美藍(lán)染色液用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)活菌數(shù)，計(jì)算黃酒酵母的存活率[30-31]。

1.3.6 不同濃度添加物對(duì)黃酒酵母乙醇耐受能力的影響

將活化后的單倍體黃酒酵母，制成種子液后以2%的接種量接入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，于28 ℃下以150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，轉(zhuǎn)移接種至含乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的外源添加物，以加入等體積去離子水作為空白對(duì)照，28 ℃下150 r/min培養(yǎng) 48 h，利用光密度法測(cè)定菌體生物量。

1.3.7 不同添加物對(duì)黃酒酵母乙醇發(fā)酵性能的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入可以最大程度促進(jìn)菌株在乙醇脅迫下生長(zhǎng)的外源添加物，以10%的接種量將種子液接入含乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28 ℃ 靜置發(fā)酵，以添加等體積去離子水作為空白對(duì)照。每隔1天進(jìn)行稱(chēng)重，并記錄失重情況，待失重小于0.2 g時(shí)，可認(rèn)為發(fā)酵基本完成，停止培養(yǎng)[32]。比較不同外源添加物對(duì)菌株發(fā)酵的逐日失重量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒酵母單倍體的分離與制備

利用產(chǎn)孢培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母BR 20進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，7天后按照1.3.2方法進(jìn)行單倍體的檢驗(yàn)，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果染色鑒定后拍照，見(jiàn)圖2。

a-未經(jīng)熱處理致死的營(yíng)養(yǎng)體；b-單倍體酵母細(xì)胞圖2 黃酒酵母子囊孢子的染色結(jié)果Fig.2 The staining results of ascospore in Chinese rice wine yeast

由圖2(a)可知，對(duì)照組未經(jīng)過(guò)熱處理致死營(yíng)養(yǎng)體，經(jīng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)染色后，可同時(shí)觀察到酵母子囊孢子與子囊細(xì)胞，顏色表現(xiàn)為紅綠并存。圖2(b)為疑似酵母單倍體菌株在生孢培養(yǎng)基培養(yǎng)后的染色結(jié)果，結(jié)果均為粉紅色，沒(méi)有被染上綠色，說(shuō)明其在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上沒(méi)有產(chǎn)生孢子，可確認(rèn)其為單倍體菌株[33]。將其編號(hào)為20-Ha后于-80 ℃條件下保藏于甘油中。

2.2 乙醇定向馴化后黃酒酵母菌株的乙醇耐受性

對(duì)20-Ha菌株按1.3.3的方法進(jìn)行乙醇定向馴化后最終得到Et 20，連續(xù)傳代并進(jìn)行表型觀察。為確定Et 20菌株沒(méi)有因?yàn)樽陨砼湫娃D(zhuǎn)換后雜交從而形成二倍體菌株，以單倍體模式菌株S288c作為對(duì)照，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸含量的測(cè)定從而進(jìn)行倍型的驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。Et 20的核酸含量峰面積為9794，與S288c的核酸含量峰面積相當(dāng)(10 000)，說(shuō)明Et 20與S288c有相似的倍性，均為單倍體菌株，Et 20沒(méi)有在乙醇定向馴化的過(guò)程中發(fā)生自雜交。

圖3 Et 20與S288c的流式細(xì)胞儀倍型驗(yàn)證Fig.3 Genome types of Et 20 and S288c by cell flow analysis

在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下下，繪制馴化前的出發(fā)菌株20-Ha與馴化株Et 20生長(zhǎng)曲線，并分別進(jìn)行18%、19%、20%、21%和22%體積分?jǐn)?shù)的乙醇沖擊，分析Et 20的乙醇耐受能力，結(jié)果見(jiàn)圖4與表1。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下Et 20與20-Ha的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strains Et 20 and 20-Ha under different ethanol concentration

圖4表明， 5%乙醇對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有太大的影響，Et 20與20-Ha表現(xiàn)出基本一致的生長(zhǎng)規(guī)律；當(dāng)培養(yǎng)基中初始乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，Et 20與20-Ha的生長(zhǎng)速率明顯降低，20-Ha的延滯期延長(zhǎng)，而Et 20的延滯期則幾乎沒(méi)有變化；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，20-Ha停止生長(zhǎng)，Et 20的延滯期延長(zhǎng)至16 h，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)間也明顯縮短，卻仍表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)活力。

經(jīng)過(guò)乙醇定向馴化后，Et 20的乙醇耐受性能得到了明顯的提高。

進(jìn)一步分析高體積分?jǐn)?shù)乙醇處理對(duì)菌株存活率的影響，由表1可知，乙醇處理體積分?jǐn)?shù)低于20%時(shí)，短時(shí)的乙醇沖擊對(duì)Et 20的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，培養(yǎng)24 h后存活率從87.9%略微下降至85.1%；20-Ha菌株則生長(zhǎng)微弱，經(jīng)18%乙醇沖擊后的存活率僅為23.2%，繼續(xù)提高乙醇濃度菌株則停止生長(zhǎng)。當(dāng)乙醇處理體積分?jǐn)?shù)高于20%時(shí)，無(wú)論是短時(shí)的乙醇沖擊或培養(yǎng)24 h，Et 20的存活率均大幅下降。OD600值從0.163降到0.092，降低了43.56%，培養(yǎng)24 h后的存活率從82.9%降低至37.3%，降低了55.01%。綜上可知，經(jīng)過(guò)定向馴化后的Et 20菌株對(duì)高體積分?jǐn)?shù)乙醇的耐受性明顯高于馴化前的出發(fā)菌株20-Ha，進(jìn)一步提高乙醇沖擊體積分?jǐn)?shù)，雖然生長(zhǎng)會(huì)受到的限制，卻仍有一定的存活率，其乙醇耐受性得到了明顯的提高。

表1定向馴化后黃酒酵母的乙醇耐受情況(n=3)

Table1EthanoltoleranceofdirectedlydomesticatedChinesericewineyeast(n=3)

乙醇體積分?jǐn)?shù)Et20乙醇沖擊4h后的存活率20-Ha乙醇沖擊4h后的存活率Et20培養(yǎng)24h后的OD60020-Ha培養(yǎng)24h后的OD60018%87.9%±0.04a23.2%±0.020.166±0.003b0.089±0.002a19%85.1%±0.03b00.173±0.005a0.032±0.001b20%82.9%±0.06c00.163±0.003cND21%61.4%±0.03d00.121±0.002dND22%37.3%±0.02e00.092±0.002eND

注：1. ND表示菌株不生長(zhǎng)；2. 右上角不同字母表示在p<0.05(Duncan)時(shí)，樣品存在顯著性差異。

2.3 不同營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)乙醇脅迫下黃酒單倍體酵母生長(zhǎng)的影響

乙醇脅迫時(shí)，酵母的生長(zhǎng)可以反映它的乙醇耐受性，高濃度乙醇存在時(shí)，菌株生長(zhǎng)的延滯期會(huì)相應(yīng)增加[7-8]，故選擇中等強(qiáng)度的乙醇進(jìn)行脅迫。在含有10%乙醇的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的脂肪酸、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、海藻糖和肌醇，培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌體的生物量，以無(wú)營(yíng)養(yǎng)添加物作為空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同添加物對(duì)乙醇脅迫下黃酒酵母生長(zhǎng)的影響 (n=3)Fig.5 The effects of different additives on the growth of Chinese rice wine yeast under ethanol stress (n=3)

在乙醇脅迫下，添加的營(yíng)養(yǎng)物均可使酵母的生物量得到顯著的提高?？梢?jiàn)，脂肪酸、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、海藻糖與肌醇的添加可在一定程度上顯著提高Et 20的乙醇耐受性。與空白對(duì)照相比，脂肪酸的添加，使Et 20的生物量提高了10%～40%，其中硬脂酸的促進(jìn)作用最大，與邢建宇等[30]、胡鐵功[34]等的研究結(jié)果一致；氨基酸的添加，使Et 20的生物量提高了14%～28%，其中谷氨酸的促進(jìn)作用最大，與梁澤新等的研究結(jié)果一致[35]；無(wú)機(jī)鹽的添加，使Et 20的生物量提高了10%～23%，其中KCl的促進(jìn)作用最大；添加海藻糖使Et 20的生物量提高了10%～16%；肌醇的添加使Et 20的生物量提高了9%～14%。乙醇脅迫時(shí)，脂肪酸的添加可以最大程度地提高單倍體酵母的乙醇耐受性，其中硬脂酸的效果最好。

隨著添加物質(zhì)量濃度的提高，Et 20的生物量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。棕櫚酸、NaCl和MgSO4在1.0 g/L時(shí)能最大程度提高Et 20的乙醇耐受性，油酸、谷氨酸、KCl為1.5 g/L，硬脂酸、甘氨酸和脯氨酸為2.0 g/L，海藻糖和肌醇為2.5 g/L；效果最佳的硬脂酸促進(jìn)提高了40%的生物量，谷氨酸次之，為28%，其后為棕櫚酸和KCl，分別促進(jìn)提高了24%和23%的生物量，海藻糖和肌醇的添加效果相對(duì)較差，均低于20%。不同種類(lèi)、不同濃度的營(yíng)養(yǎng)添加物可以不同程度地提高Et 20的乙醇耐受性，總體而言，脂肪酸的促進(jìn)作用優(yōu)于氨基酸，無(wú)機(jī)鹽、海藻糖和肌醇分別次之。

2.4 不同營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)黃酒單倍體酵母發(fā)酵性能的影響

在實(shí)際發(fā)酵及酒的釀造過(guò)程中通常會(huì)采用CO2的損失量來(lái)表征酵母菌株的發(fā)酵能力和發(fā)酵強(qiáng)度。在10%乙醇脅迫下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入最大程度促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的添加物(2.3分析結(jié)果)，不同營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)Et 20發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的CO2失重情況如圖6所示。

圖6 不同添加物對(duì)乙醇脅迫下黃酒酵母發(fā)酵性能的影響 (n=3)Fig.6 The effects of different additives on the fermentation performance of Chinese rice wine yeast under ethanol stress (n=3)

從圖6可以看出，發(fā)酵過(guò)程中，添加不同營(yíng)養(yǎng)物后Et 20的總發(fā)酵強(qiáng)度均明顯高于空白對(duì)照。不同的營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)Et 20發(fā)酵釋放產(chǎn)生CO2的規(guī)律基本相同：在發(fā)酵1天后出現(xiàn)了單日最大的CO2釋放量；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，CO2的失重量也逐漸降低。黃酒發(fā)酵為半開(kāi)放式發(fā)酵，故用于發(fā)酵的黃酒酵母一般采用“前急后緩”菌種，即在發(fā)酵初期酵母可迅速增殖形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)從而抑制細(xì)菌過(guò)度的生長(zhǎng)引發(fā)的酸敗。Et 20亦符合該種模式，故發(fā)酵3天后，在乙醇積累與營(yíng)養(yǎng)消耗的雙重脅迫下，發(fā)酵強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，但不同營(yíng)養(yǎng)添加物對(duì)Et 20在乙醇脅迫下的發(fā)酵性能產(chǎn)生了不同的影響。相比空白對(duì)照，海藻糖在乙醇脅迫下能較好地提高Et 20的總發(fā)酵強(qiáng)度，脂肪酸、氨基酸與無(wú)機(jī)鹽分別次之，而肌醇的效果相對(duì)較差。添加的脂肪酸中，硬脂酸添加后，Et 20在發(fā)酵3天后的發(fā)酵強(qiáng)度下降幅度最低；添加的氨基酸中，甘氨酸能較好的提高Et 20的發(fā)酵性能；而所添加的3種無(wú)機(jī)鹽則作用相當(dāng)。

在10%乙醇脅迫下，添加海藻糖可最大限度地提高Et 20的總發(fā)酵強(qiáng)度(4.63 g)，較空白對(duì)照(3.33 g)高出了39.04%；硬脂酸添加效果次之，發(fā)酵8天后Et 20累積的總CO2失重量(4.20 g)較對(duì)照高出26.13%；其后為甘氨酸，Et 20總發(fā)酵強(qiáng)度提高了14.71%；無(wú)機(jī)鹽的添加最大可提高12.31%的總發(fā)酵強(qiáng)度；添加肌醇后則僅提高了7.21%的發(fā)酵強(qiáng)度。隨著發(fā)酵的深入與乙醇的積累，添加外源營(yíng)養(yǎng)物可不同程度地降低乙醇脅迫對(duì)黃酒酵母發(fā)酵性能的影響。海藻糖作為細(xì)胞內(nèi)源性的“保護(hù)物質(zhì)”，雖然可極大促進(jìn)Et 20在乙醇脅迫下的發(fā)酵強(qiáng)度，但在促進(jìn)菌株在乙醇脅迫下的生長(zhǎng)卻沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)；而硬脂酸既可以較好地促進(jìn)Et 20在乙醇脅迫下的生長(zhǎng)，同時(shí)也可以較大程度地提高Et 20的發(fā)酵強(qiáng)度。

3 結(jié)論

為選育高乙醇耐受性的黃酒酵母，為后期黃酒育種提供優(yōu)質(zhì)的前提，本課題通過(guò)菌種單倍體化與乙醇定向馴化獲得了1株可耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%的單倍體釀酒酵母Et 20，在一定乙醇脅迫條件下添加不同種類(lèi)的脂肪酸、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽離子、海藻糖和肌醇，這些添加物均能不同程度提高Et 20菌株的乙醇耐受性，并且隨著添加濃度的升高，外源添加物有先提高后降低菌株乙醇耐受性的趨勢(shì)。硬脂酸能最大限度提高Et 20的乙醇耐受性，谷氨酸、KCl分別次之，海藻糖與肌醇的添加效果則相對(duì)較差。在10%乙醇脅迫下，添加海藻糖與硬脂酸能較大程度降低乙醇脅迫對(duì)Et 20發(fā)酵的影響，可分別提高39.03%與26.12%的總發(fā)酵強(qiáng)度。海藻糖雖然可極大程度促進(jìn)Et 20在乙醇脅迫下的發(fā)酵強(qiáng)度，卻對(duì)提高菌株的乙醇耐受性沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)；而硬脂酸既可以較好地促進(jìn)Et 20在乙醇脅迫下的生長(zhǎng)，也可以較大程度地提高Et 20的發(fā)酵強(qiáng)度。定向馴化高乙醇耐受性黃酒酵母，為選育優(yōu)良的黃酒發(fā)酵菌種提供前提，對(duì)優(yōu)質(zhì)黃酒的釀造具有重要的意義。

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