李貴節(jié)，譚祥，翟雨淋,4，程玉嬌，王珺，王華*，RUSSELL LEE ROUSEFF ,3，吳厚玖

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶第二師范學(xué)院，重慶，400067) 3(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 4(西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶，400715)5(生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶第二師范學(xué)院，重慶，400067)

甜橙(CitrussinensisOsbeck)是全球消費(fèi)量最大、栽培量最多的柑橘類群，因其特征性的酸甜口感和較高的營養(yǎng)價(jià)值深受人們的喜愛[1]。除了果實(shí)的加工性能、營養(yǎng)成分和口感風(fēng)味等項(xiàng)目，其所含功能性物質(zhì)也逐漸成為考察的備選項(xiàng)。

多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones, PMFs)是柑橘果實(shí)中特有的類黃酮，其共性是多個羥基甲基化[2]；該類物質(zhì)比其他植物性黃酮有更高的生物利用度和生理作用，具有明確的抗癌活性和降血脂功能[3-5]。PMFs主要富集于果皮油胞層中，現(xiàn)已分離鑒別出數(shù)十種，常見有川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、七甲氧基黃酮等[6]。甜橙含有豐富的多甲氧基黃酮資源，其果肉、果汁中的含量雖然與果皮相比甚微，然而不論是鮮食還是汁用，其日常消費(fèi)量大且?guī)缀醢殡S一生，因此人們攝入的PMFs總量相當(dāng)可觀。因此有必要對不同品種甜橙果汁中PMFs的種類和含量進(jìn)行分析檢測，以了解其差異性。

對于PMFs的分析和檢測，傳統(tǒng)上是用高效液相色譜搭配二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)[7-11]。該方法儀器設(shè)備簡單、具有一定的定性能力，但儀器檢測限較高，特別對于PMFs含量低、干擾物較復(fù)雜的橙汁來說，容易出現(xiàn)無法檢出的情況。近年來，越來越多的研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[12-15]，串聯(lián)質(zhì)譜的突出優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、選擇性好、定性準(zhǔn)確，對于復(fù)雜樣品色譜分離的要求大大降低。然而，HPLC-MS/MS價(jià)格昂貴、運(yùn)行成本高、操作復(fù)雜、分析周期長，且不具備便攜性，無法進(jìn)行現(xiàn)場快速分析。對于一個應(yīng)用型分析檢測方法的開發(fā)，這些因素需要充分考慮在內(nèi)。

固相萃取(SPE)是廣泛應(yīng)用在食品、生物、藥學(xué)、環(huán)境等眾多領(lǐng)域的樣品前處理技術(shù)，具有提取濃縮目標(biāo)物質(zhì)、去除干擾物質(zhì)、溶劑用量少、操作簡單快速等優(yōu)良性能[16]。利用SPE對甜橙汁中的PMFs進(jìn)行富集和濃縮，在DAD的基礎(chǔ)上再加入熒光檢測器(FLD)，通過對各個PMF物質(zhì)的紫外和熒光特征光譜的獲取，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性分析，確定兩種檢測器定量分析的最佳條件，從而建立同時檢測汁用甜橙中9種多甲氧基黃酮物質(zhì)的快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

汁用甜橙：共計(jì)11個品系。早熟甜橙，包括早熟長葉橙、渝早橙、早金和哈姆林；中熟甜橙，包括中熟長葉橙、鵝蛋柑(錦橙26號)、銅水72-1和特羅維塔；晚熟甜橙，包括晚熟長葉橙，德爾塔夏橙和奧林達(dá)夏橙。樣品于2016年各自成熟期采自重慶市忠州區(qū)。固相萃取柱：HyperSep C18柱，德國Thermo-fisher Scientific公司；0.22 μm有機(jī)相微孔濾頭：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；H3PO4、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司。標(biāo)準(zhǔn)對照品：異甜橙黃酮、甜橙黃酮、六甲氧基櫟草亭、四甲氧基異野黃岑素、川陳皮素、四甲氧基野黃岑素、七甲氧基黃酮、5-去甲基川陳皮素、橘皮素等9種：其詳細(xì)信息和結(jié)構(gòu)簡式見表1和圖1。所有標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(TSQ Quantum，德國Thermo Scientific公司)檢驗(yàn)確認(rèn)，為其標(biāo)稱物質(zhì)，達(dá)到標(biāo)稱純度。

表1 多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

圖1 九種多甲氧基黃酮結(jié)構(gòu)簡式Fig.1 Schematic structures of the nine polymethoxyflavones

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀串聯(lián)二極管陣列檢測器及熒光檢測器(HPLC-DAD/FLD)，德國Thermo Scientific公司；KQ5200DE超聲清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；VacMaster負(fù)壓固相萃取系統(tǒng)，瑞典Biotage公司； HN200多功能氮吹儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，德國Merck-Millpore公司； MPZ9柑橘榨汁機(jī)，德國Braun公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5.00 mg，分別用甲醇溶解，并定容至5.00 mL，配成1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液備用。吸取各儲備液0.5 mL，混合并定容至5.00 mL，得到各物質(zhì)質(zhì)量濃度均為0.10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液；逐級稀釋得到一系列質(zhì)量濃度分別為100、25、10、2.5、1、0.25、0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 橙汁前處理

SPE柱用5 mL甲醇活化、5 mL超純水平衡備用。將甜橙洗凈晾干后切半，利用錐式榨汁機(jī)手動榨取新鮮橙汁，經(jīng)8層紗布粗濾，取適量濾后橙汁緩慢通過活化的SPE柱，以使柱床充分吸附PMFs等物質(zhì)，再依次通入超純水和清洗液(30%體積分?jǐn)?shù)的乙腈水溶液)除去雜質(zhì)；目標(biāo)物質(zhì)用5 mL乙酸乙酯洗脫，40°C經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥? mL甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，制得 PMFs樣品。

1.3.3 橙汁過柱體積-目標(biāo)物質(zhì)吸附總量曲線

將不同品種的橙汁等量均勻混合，以消除PMFs含量的種間差異。分別取5、10、15、20、25和30 mL混合橙汁過SPE柱，按前處理步驟制得不同濃度的PMFs樣品。繪制PMFs響應(yīng)值-過柱體積曲線，選擇適宜的前處理體積。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore C8(2.6 μm, 4.6 mm×50 mm)；流動相：0.05% H3PO4溶液、甲醇和50%四氫呋喃溶液，流動相梯度見表2；檢測器設(shè)置：DAD波長掃描范圍為210～400 nm；FLD 激發(fā)波長掃描范圍為250～400 nm，發(fā)射波長掃描范圍為360～550 nm。其他設(shè)置：柱溫30°C，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5.0 μL 。

表2 HPLC流動相洗脫程序

1.3.5 樣品成分的定性和定量分析

以紫外吸收光譜掃描圖、熒光發(fā)射光譜掃描圖以及色譜峰保留時間三者結(jié)合進(jìn)行化合物的定性判斷。采用外標(biāo)法定量，檢測波長的選擇見下文。

2 結(jié)果、分析與討論

2.1 紫外和熒光檢測波長的選擇

利用DAD和FLD對9種多甲氧基黃酮進(jìn)行掃描，得到各物質(zhì)的紫外吸收、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。如圖2-A所示，9種PMFs的最大紫外吸收波長集中在320～345 nm；綜合考慮各物質(zhì)的紫外響應(yīng)值，選擇330 nm作為檢測波長。熒光激發(fā)光譜與紫外光譜較為相似，故本處略去，選擇340 nm為激發(fā)波長。圖2-B顯示該波長激發(fā)下，各物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜。由圖2-B可知，四甲氧基異野黃岑素(4)、5-去甲基川陳皮素(8)和橘皮素(9)未檢出熒光信號；異甜橙黃酮(1)和四甲氧基野黃岑素(6)為雙峰，分別在400 nm和500 nm附近，且熒光強(qiáng)度顯著低于其他物質(zhì)；其他PMFs為單峰，最大響應(yīng)值在450 nm附近。綜合考慮選擇450 nm和500 nm作為熒光檢測波長。

圖2 多甲氧基黃酮的紫外吸收光譜(A)和熒光發(fā)射光譜(B)Fig.2 UV absorbance spectra(A) and fluorescence emission spectra(B) of PMFs

2.2 色譜柱、流動相的選擇和梯度條件優(yōu)化

PMFs高度甲基化，極性中弱，使用C8鍵合相保留效果較好。PMFs含有相同的母核結(jié)構(gòu)，性質(zhì)較為接近，為實(shí)現(xiàn)其快速分離，在保證高柱效的前提下，需合理增大流速，同時又要避免反壓超過HPLC的承壓范圍。綜合以上因素，最終選用表面多孔實(shí)心填料短柱(2.6 μm, 4.6 mm×50 mm，Thermo Scientific Accucore)。該色譜柱為反相柱，采用C8填料，適用于中等極性到弱極性物質(zhì)的分離。其最大特點(diǎn)在于，填料為部分多孔結(jié)構(gòu)，即包含一個φ1.6 μm的實(shí)心核和0.5 μm厚的多孔外殼。與全多孔填料相比，該結(jié)構(gòu)使分子運(yùn)動路徑更短，降低了被分離物質(zhì)的軸向擴(kuò)散，減小了色譜峰的展寬，從而獲得更高的柱效和分辨率，同時將柱壓維持在3×107Pa以下。

對于流動相，分別以水/甲醇(體積比50∶50)和水/乙腈(體積比60∶40)出發(fā)、對應(yīng)的純有機(jī)溶劑為終點(diǎn)，設(shè)置初始斜線梯度，并在此基礎(chǔ)上分別對梯度進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果顯示，水/甲醇體系下，川陳皮素(5)和四甲氧基野黃岑素(6)無法分離；水/乙腈體系下，(5)、(6)的分離度有所改善(≈1.0)，但5-去甲基川陳皮素(8)和橘皮素(9)無法分離。因此再引入第3種組分四氫呋喃(THF)，經(jīng)系列調(diào)整確定水/甲醇/THF梯度洗脫能有效分離化合物1～7，但8、9分離效果仍不理想。從結(jié)構(gòu)分析，5-去甲基川陳皮素(8)具有游離酚羥基，故可通過降低流動相pH調(diào)整其保留性質(zhì)。由于H3PO4在各波長下均無顯著紫外吸收，故采用色譜純的H3PO4降低流動相的pH值,在優(yōu)化的流動相組成和洗脫程序下(表2)。9種PMFs混標(biāo)的紫外和熒光響應(yīng)色譜圖如圖3所示。各物質(zhì)峰型良好，在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離(分離度R>1.5)；熒光信號以倒峰的形式呈現(xiàn)，以便更清晰的與紫外信號對應(yīng)。

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

在1.3.4色譜條件下，測定逐級稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各物質(zhì)響應(yīng)的積分峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定儀器信噪比(S/N)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3

圖3 多甲氧基黃酮混合標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the mixed PMFs standard solution

表3紫外和熒光測定多甲氧基黃酮的線性關(guān)系、儀器檢出限和定量限

Table3Linearrelativity,LODandLOQofthePMFsbyUVandfluorescenceexamination

多甲氧基黃酮UV測定值FL測定值線性范圍/(mg·L-1)回歸方程R2檢出限/(mg·L-1)定量限/(mg·L-1)線性范圍/(mg·L-1)回歸方程R2檢出限/(mg·L-1)定量限/(mg·L-1)異甜橙黃酮2.00～1000Y=2.59X-2.15b0.99980.1100.36630～1000Y=0.0325X-0.730.99941.8306.100甜橙黃酮4.00～1000Y=3.33X+0.231.00000.1840.6121.50～500Y=2.54X+0.111.00000.0840.280六甲氧基櫟草亭1.50～500Y=1.57X+1.840.99990.0820.2721.50～500Y=0.478X+0.190.99950.0720.242四甲氧基異野黃岑素1.00～1000Y=2.87X+0.521.00000.0360.124-----川陳皮素1.50～1000Y=2.64X+4.410.99970.0600.2022.00～500Y=0.23X+0.490.99980.1020.338四甲氧基野黃岑素1.00～1000Y=5.19X+3.490.99960.0560.18810～1000Y=0.111X-1.440.99980.6042.014七甲氧基黃酮0.50～1000Y=5.29X+0.300.99990.0240.0785.00～500Y=0.21X-0.270.99960.2860.9545-去甲基川陳皮素1.00～500Y=2.41X+5.730.99990.0400.132-----橘皮素0.20～1000Y=6.88X+1.310.99980.0120.040-----

注：(1)異甜橙黃酮和四甲氧基野黃岑素的熒光信號在發(fā)射波長為500 nm處獲得，其他熒光響應(yīng)均在450 nm處采集(表4、表5同)；(2)回歸方程中Y為峰面積，X為物質(zhì)濃度；-表示該物質(zhì)沒有熒光響應(yīng)。

2.4 SPE前處理?xiàng)l件的確定

影響SPE前處理效果的因素有：鍵合相、柱體積、柱床填量、清洗液、洗脫液及過柱量等?？紤]PMFs的性質(zhì)、方法對快速前處理的要求以及成本控制，選用SPE柱規(guī)格為：C18鍵合相、6 mL柱體積，500 mg柱床填量。清洗除雜分為兩步，先用超純水去除殘留橙汁的水溶性成分，如：糖類、有機(jī)酸、VC等；再用一定強(qiáng)度的溶劑去除吸附力較弱的干擾成分，如：黃酮苷、花色苷、類胡蘿卜素等。就第二步清洗液的組成，分別考察體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%的甲醇和乙腈溶液，發(fā)現(xiàn)30%乙腈溶液除雜效果明顯且對目標(biāo)PMFs無洗脫作用。分別考察5 mL甲醇、乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷、異丙醇對PMFs的洗脫效率。結(jié)果表明，在1 mL/min流速下，5種溶劑均能將PMFs從SPE柱上完全洗脫；在2 mL/min流速下，甲醇洗脫不完全，其余4種溶劑能夠完全洗脫。綜合考慮毒性和揮發(fā)速率，選擇乙酸乙酯為洗脫劑。

對于橙汁的過柱量，在避免柱床對目標(biāo)物質(zhì)吸附飽和的前提下，應(yīng)盡量提高過柱體積以獲得高濃度的最終樣品，從而降低檢測誤差。過柱體積-目標(biāo)物質(zhì)吸附總量曲線見圖4。其中PMFs吸附量由UV和FL響應(yīng)分別表示，以橙汁所含總PMFs對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)單位。由圖4可知，0～20 mL內(nèi)，吸附量與過柱體積成良好的線性相關(guān)；進(jìn)一步增加過柱體積，線性關(guān)系被破壞，最終洗脫得到的PMFs趨于恒定，說明大于20 mL上樣使柱床吸附飽和，目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生穿透現(xiàn)象而損失?？紤]到加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的需要，SPE吸附量應(yīng)留有至少一半的余量，故確定橙汁的過柱體積為10 mL。

圖4 固相萃取處理橙汁體積與最終樣品中多甲氧基黃酮總響應(yīng)值的關(guān)系Fig.4 Relationship between the processed volume of orange juice through SPE and the total response of PMFs in final HPLC samples注：■和●分別表示符合線性關(guān)系的紫外和熒光響應(yīng)；□和○分別表示固相萃取柱吸附飽和時紫外和熒光響應(yīng)。

2.5 重現(xiàn)性和精密度

混合橙汁經(jīng)SPE前處理、HPLC-DAD/FLD法測定各PMF的本底含量。再分別以80%、100%、120%三個水平做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個水平做3次重復(fù)測定，驗(yàn)證整套方法的重現(xiàn)性和精密度。結(jié)果如表4所示，各PMF回收率分別為UV: 96.4%～104.2%和FL: 94.2%～102.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.4%～5.9%和2.2%～7.6%。本方法準(zhǔn)確度和精密性良好，UV和FL定量數(shù)據(jù)可相互驗(yàn)證，具有較高可信度。

表4 甜橙混合果汁的多甲氧基黃酮回收率

續(xù)表4

化合物加入量/(mg·L-1)UV測定值FL測定值本底值/(mg·L-1)測定量/(mg·L-1)回收率/%RSD/%本底值/(mg·L-1)測定量/(mg·L-1)回收率/%RSD/%四甲氧基野黃岑素8.4010.5012.6010.5019.0420.8523.09101.798.699.92.64.33.310.5218.6820.8322.9397.198.298.55.16.44.9七甲氧基黃酮17.2521.5625.8721.5638.4542.9347.3397.999.199.62.53.12.621.1838.2941.9647.0299.296.499.93.72.22.85-去甲基川陳皮素3.093.864.633.866.847.628.5096.497.3100.21.41.52.63.636.547.528.3194.2100.9101.13.03.24.1橘皮素5.476.848.216.8412.2313.6715.0698.599.8100.12.12.52.46.9512.3913.6715.1099.598.399.37.04.23.0

2.6 應(yīng)用實(shí)例

用建立的SPE-HPLC-DAD/FLD法對11個常見汁用甜橙品系的果汁PMFs進(jìn)行定性和定量測定。如圖5所示，經(jīng)SPE前處理后，各樣品的UV和FL色譜峰型正常、分離度良好，雜質(zhì)峰較少且集中在前3 min范圍內(nèi)，對目標(biāo)物質(zhì)分析干擾小。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合紫外光譜、熒光發(fā)射光譜和保留時間3種不同的手段定性，方法如下：各PMF標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜信息互不相同，具有其特征性(圖2)；據(jù)此建立PMFs的UV/FL光譜數(shù)據(jù)庫，將樣品中目標(biāo)峰的光譜與庫中已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對比，再加上色譜峰保留時間的對應(yīng)關(guān)系，從而準(zhǔn)確判定該目標(biāo)物質(zhì)是否為已知PMF。

同時測定UV和FL響應(yīng)值，采用外標(biāo)法對樣品中的PMFs定量分析，根據(jù)SPE前處理的富集倍數(shù)，計(jì)算汁用甜橙果汁中各物質(zhì)的含量，結(jié)果見表5。2種信號的定量結(jié)果吻合度良好，相對平均偏差為0.03%～5.42%。數(shù)據(jù)顯示，汁用甜橙果汁中總PMFs的平均含量為mg/L級；甜橙黃酮(2)是所有品系中含量最高的PMF，川陳皮素(5)含量次之，兩者之和占橙汁總PMFs含量的50%以上，為其主要成分。MOULY等[17]利用C18SPE前處理和HPLC-DAD法對市售60種橙汁進(jìn)行了PMFs含量分析，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處于同一數(shù)量級，但各PMF濃度均值普遍較低，且川陳皮素含量高于甜橙黃酮。這些差別也從側(cè)面反映出加工甜橙品種選擇對于橙汁品質(zhì)的重要性。11個品系間比較，渝早橙PMFs總含量最高，為鵝蛋柑的10倍以上，加之其早熟的特性，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的潛力。

3 結(jié)論

A-早熟品系；B-中熟品系；C-晚熟品系圖5 11種汁用甜橙果汁樣品中所含多甲氧基黃酮的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of PMFs contained in eleven juice-producing sweet orange juice samples

建立了SPE-HPLC-DAD/FLD快速前處理甜橙汁及檢測其中9種多甲氧基黃酮成分的方法。前處理利用C18柱固相萃取，在去除雜質(zhì)干擾的同時實(shí)現(xiàn)果汁樣品中微量PMFs的富集，間接提升了樣品檢測的靈敏度。以0.05%磷酸、甲醇、50%四氫呋喃為流動相，使用表面多孔實(shí)心填料C8柱進(jìn)行反相HPLC梯度洗脫，9種PMFs在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離。DAD和FLD的同時使用，從光譜學(xué)角度為樣品中目標(biāo)物質(zhì)的定性提供了判斷依據(jù)。在UV吸收波長330 nm，F(xiàn)L激發(fā)波長340 nm、發(fā)射波長450和500 nm的條件下，同時對樣品PMFs定量分析，兩者結(jié)果一致性良好。該方法定量限達(dá)mg/L級加標(biāo)回收率為96.4%～104.2%(UV)和94.2%～102.1%(FL)，具有良好的精密度和重現(xiàn)性。對11個品系的汁用甜橙進(jìn)行了分析，利用該方法能滿足常規(guī)HPLC對橙汁中微量PMFs的快速定量檢測要求。

表5 11種汁用甜橙原汁中多甲氧基黃酮含量

注：根據(jù)SPE富集倍數(shù)，原汁濃度由最終制備樣品的實(shí)測濃度換算而來，保留3位有效數(shù)字； ND為未檢出(低于檢測限)，

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