趙梓瀛，樸春紅,*，王玉華，劉俊梅，于寒松，代偉長，唐玉芳，王 婧，劉岱琳*

蕎麥屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），起源于我國[1]。其農(nóng)業(yè)種植的兩個重要品種分別是甜蕎麥（F. esculentum Moench）和苦蕎麥（F. tataricum（L.）Gaertn.）。甜蕎麥在世界分布廣泛，苦蕎麥為我國獨(dú)有農(nóng)作物[2]。我國的苦蕎種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[3]。蕎麥作為一種藥食同源的天然綠色食品資源，含有較多的生物黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)通過抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性、擬胰島素作用、抗炎、抑制醛糖還原酶和抑制蛋白糖基化等多種途徑來防治糖尿病，同時通過抵抗血小板凝集、微血管病變等作用改善糖尿病并發(fā)癥[4]。傳統(tǒng)治療糖尿病的藥物都具有不同程度的副作用，因此在天然產(chǎn)物中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑、蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）抑制劑成為糖尿病治療領(lǐng)域研究的熱門方向。

蕎麥殼是蕎麥生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)物，且產(chǎn)量大、價格低廉。其藥理作用和有效化學(xué)成分與蕎麥具有相似之處，但目前對其藥理研究和開發(fā)利用較少[5]。近幾年研究表明蕎麥成分對慢性疾病治療有突出的效果，因此倍受食品科學(xué)家的重視[6]。很多文獻(xiàn)證實(shí)蕎麥提取物具有降血糖、抑制AGEs形成的功效[7-8]。本課題組前期研究結(jié)果表明，蕎麥殼黃酮提取物可顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠空腹血糖含量，同時證實(shí)其還具有修復(fù)胰島細(xì)胞功能，且具有量效關(guān)系[9]。為了深入研究蕎麥殼黃酮類物質(zhì)成分及其與抗糖尿病活性的關(guān)系，本實(shí)驗對蕎麥殼提取物（buckwheat hull extract，BHE）進(jìn)一步分離純化后，研究各組分體外抗糖尿病生物活性并對活性最優(yōu)組分進(jìn)行成分分析，為蕎麥殼活性及成分鑒定提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蕎麥殼購于內(nèi)蒙古赤峰市；BHEs制取參照樸春紅等[10]的方法。

蘆丁（純度≥98%） 美國Bellancom Life Science公司；α-葡萄糖苷酶（＞10 000 U） 北京Solarbio公司；葡萄糖氧化酶試劑盒 上海恒遠(yuǎn)試劑公司；D101大孔樹脂、AB-8大孔樹脂 東鴻化工有限公司；葡萄糖北京化工廠；D-果糖、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、丙酮醛（methylglyoxal，MGO） 美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；iFD-1P-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司；infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；3K15離心機(jī) 美國Sigma公司；SYNERGYHT多功能酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司；DHP/20恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗儀器廠有限公司；LCMS2020型高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatograph-mass spectrometer，HPLC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔樹脂分離純化

1.3.1.1 大孔樹脂的預(yù)處理

參照胡月等[11]的方法并加以改進(jìn)。分別將D101大孔樹脂、AB-8大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，對其進(jìn)行初步除雜。濾去乙醇，用蒸餾水洗至無味。依次用4% HCl和4% NaOH溶液浸泡24 h，每次浸泡結(jié)束后用蒸餾水洗至pH 7.0，最后浸泡于95%乙醇中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 D101大孔樹脂一次純化

處理好的D101大孔樹脂濕法裝柱，待柱料平穩(wěn)后，以2 mL/min流速加入BHE溶液100 mL，待BHE吸附后，蒸餾水以4 BV/h流速洗去未吸附的BHE樣品，最后用70%乙醇以2 BV/h流速洗脫至流出液無顏色，洗脫液冷凍干燥后獲得D101大孔樹脂精制物（purified buckwheat hull extract，PBHE）備用。

1.3.1.3 AB-8大孔樹脂二次純化

處理好的AB-8型大孔樹脂濕法裝柱，待柱料平穩(wěn)后，以0.5 BV/h流速加入20 mL PBHE樣品，2 BV/h流速洗脫。洗脫劑依次為純水2 BV（BHE-M1）、純水3 BV（BHE-M2）、10%乙醇4 BV（BHE-M3）、40%乙醇11 BV（BHE-M4）、95%乙醇4 BV（BHE-M5）。分別收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥后得到AB-8大孔樹脂純化組分（BHE-M）備用。

1.3.2 總黃酮含量測定

利用NaNO2-Al(NO3)3比色法來檢測各分離純化組分總黃酮含量[12]。500 μL待測樣品液與1.0 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇混合后加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaNO2溶液，靜置反應(yīng)6 min，加250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液于上述反應(yīng)液中再靜置反應(yīng)6 min，最后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液混勻。分別取出200 μL加至96 孔板中，利用酶標(biāo)儀在510 nm波長處檢測其吸光度。參照上述方法制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mL作為樣品，510 nm波長處測其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到線性回歸方程為Y＝0.297 6X＋0.052 2，R2＝0.999 4，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各總黃酮含量。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活力抑制率測定

以麥芽糖為底物，α-葡萄糖苷酶活力抑制率測定方法參照范文婭[13]、韓淑英[14]等的報道并加以改良。依次取60 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液，40 μL α-葡萄糖苷酶（5 mg/mL），80 μL麥芽糖（20 mmol/L）于1.5 mL EP管中混勻，加入20 μL待測樣品溶液（1.25、2.50、10.00 mg/mL），40 ℃溫育40 min后沸水加熱5 min終止反應(yīng)。離心2 min（4 ℃、1 000 r/min），取上清液10 μL于1.5 mL EP管中，加入葡萄糖氧化酶試劑盒中R1、R2混合液1 000 μL，37 ℃溫育15 min，取200 μL至96 孔板中，505 nm波長處測吸光度。計算公式如式（1）所示。

式中：A空白為不加樣品的吸光度；A樣品為各質(zhì)量濃度樣品孔的吸光度；A顏色對照為顏色對照孔的吸光度。

1.3.4 AGEs抑制率測定

1.3.4.1 葡萄糖-BSA、果糖-BSA體系制備

參照Wang Xuan等[15]的方法進(jìn)行并略作改動：分別用磷酸鹽緩沖液（200 mmol/L、pH 7.4）配制10 mg/mL的BSA溶液、500 mmol/L的葡萄糖溶液和果糖溶液、不同質(zhì)量濃度的實(shí)驗樣品（BHE、PBHE、BHE-M）。1.5 mL EP管中依次加入120 μL葡萄糖溶液（果糖溶液）、240 μL BSA溶液、反應(yīng)終質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.200 mg/mL的實(shí)驗樣品。密封好EP管，80 ℃避光條件下培養(yǎng)6 h后分別取200 μL至黑色酶標(biāo)板中測定AGEs生成量。實(shí)驗分組如下：空白對照組（不含還原糖和抑制劑）、對照組（不含抑制劑）、實(shí)驗組（抑制劑為實(shí)驗樣品）、陽性對照組（抑制劑為胺基胍（amino guanidine，AG））。

1.3.4.2 MGO-BSA體系制備

MGO-BSA體系制備參照Harsha[16]和Pokkaew[17]等的方法略有改動：1 mL MGO（20 mmol/L）加到20 mL BSA（20 mg/mL）溶液中，取上述MGO-BSA混合液280 μL至黑色酶標(biāo)板中，對應(yīng)加入20 μL實(shí)驗樣品（BHE、PBHE、BHE-M），反應(yīng)中所用溶劑皆為磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L、pH 7.4）。充分混勻后50 ℃避光條件下培養(yǎng)24 h后測定AGEs生成量。實(shí)驗分組為：空白對照組（不含MGO和抑制劑）、對照組（不含抑制劑）、實(shí)驗組（抑制劑為實(shí)驗樣品）、陽性對照組（抑制劑為AG）。

1.3.4.3 AGEs抑制率檢測

利用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長360 nm和發(fā)射波長460 nm，增益50的條件下，檢測其熒光強(qiáng)度，計算公式如式（2）所示。

式中：FLs為實(shí)驗組的熒光強(qiáng)度；FLb為空白組的熒光強(qiáng)度；FLc為對照組的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 BHE-M4中黃酮類物質(zhì)成分分析

1.3.5.1 樣品的準(zhǔn)備

精密稱取BHE-M4樣品100 mg，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇后密封瓶口，超聲處理1 h（40 kHz、250 W），冷卻后過濾，少量甲醇洗滌濾渣并將洗滌液與濾液合并，減壓加熱干燥。

干燥后的樣品用90%甲醇水溶液溶解，過C18固相萃取小柱，90%甲醇水溶液為洗脫液，棄去前1 mL洗脫液，接收中間3 mL洗脫液，真空干燥后備用。

1.3.5.2 HPLC-MS分析條件

取1.3.5.1節(jié)干燥樣品以甲醇溶解后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取10 μL樣品進(jìn)樣分析。使用LCMS2020型HPLC-MS聯(lián)用儀，掃描速率為15 000 D/s，正負(fù)極性切換時間為15 ms。乙腈為流動相A，水為流動相B，洗脫條件：0～40 min，流動相A：5%～90%；40～45 min，流動相A：90%；45～50 min，流動相A：90%～5%。流速：1 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各組分總黃酮含量

圖1 大孔樹脂純化組分中總黃酮含量Fig. 1 Total ぼavonoid contents of BHE and its fractions

BHE經(jīng)兩種不同型號大孔樹脂純化后，各組分總黃酮含量測定結(jié)果見圖1。BHE總黃酮含量為30.8 g/100 g，經(jīng)D101大孔樹脂一次純化后總黃酮含量升高約一倍，為65.3 g/100 g。經(jīng)AB-8大孔樹脂二次純化后黃酮類化合物基本集中在BHE-M4和BHE-M5兩個組分，其中BHE-M4組分總黃酮含量為89.2 g/100 g。楊喆等[18]以D101大孔樹脂分純化山杏核殼總黃酮，總黃酮含量達(dá)到51.63%；楊芙蓮等[19]以AB-8大孔樹脂甜蕎麥殼類總黃酮含量由27.9%提高到59.5%；陳晶等[20]用AB-8大孔樹脂分離純化枇杷花總黃酮，純化后樣品總黃酮含量達(dá)74.82%。本實(shí)驗中BHE依次經(jīng)D101大孔樹脂、AB-8大孔樹脂兩次純化后，總黃酮含量與已有文獻(xiàn)結(jié)果相似，結(jié)果表明蕎麥殼黃酮經(jīng)大孔樹脂兩次純化后總黃酮含量有顯著提高，便于進(jìn)行后續(xù)成分分析及活性實(shí)驗。

2.2 純化組分α-葡萄糖苷酶活力抑制率

圖2 大孔樹脂純化前后蕎麥殼提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性Fig. 2 Inhibitory activity of BHE and its fractions against α-glucoside

α-葡萄糖苷酶又稱α-D-葡萄糖苷水解酶，是一類低聚糖水解酶，也是機(jī)體內(nèi)碳水化合物消化的關(guān)鍵酶，同時參與機(jī)體內(nèi)糖蛋白、糖脂和糖肽的合成。通過降解機(jī)體內(nèi)多糖，裂解α-1、α-4糖苷鍵釋放葡萄糖使機(jī)體血糖濃度升高。α-葡萄糖苷酶抑制劑雖不刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，但可通過抑制這一系列反應(yīng)，降低餐后血糖水平，是比較成熟的治療糖尿病藥物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。李鵬程等[9]研究表明BHE具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活力的作用，尤其對α-葡萄糖苷酶-麥芽糖體系的降解作用高于α-葡萄糖苷酶-硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷。因此本實(shí)驗采用α-葡萄糖苷酶-麥芽糖體系進(jìn)行實(shí)驗。由圖2可知，除BHE-M1組分外，其他組分對α-葡萄糖苷酶活力有明顯的抑制，且呈劑量依賴關(guān)系。BHE-M4組分對α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果最強(qiáng)，在1.000 mg/mL時抑制率最高為28.23%，而同等質(zhì)量濃度下BHE的抑制率為16.03%。陽性對照組阿拉伯糖5 mg/mL時抑制率僅為2.94%（圖中未標(biāo)注）。朱麗艷等[21]研究表明蕎麥花總黃酮對α-葡萄糖苷酶活力抑制率分別為35.79%～54.74%，結(jié)果略高于本研究中的BHE-M4組分，而蕎麥麩皮黃酮類物質(zhì)及小葉薜荔根莖黃酮類物質(zhì)在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯[22-23]。張海鳳等[24]分別用大鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶提取液和市售α-葡萄糖苷酶建立α-葡萄糖苷酶抑制劑模型，發(fā)現(xiàn)不同來源α-葡萄糖苷酶活力有一定差異。而本實(shí)驗樣品與已發(fā)表文獻(xiàn)中蕎麥相關(guān)黃酮的α-葡萄糖苷酶活力抑制率相比較低，這可能與蕎麥產(chǎn)地、提取部位以及α-葡萄糖苷酶的來源有關(guān)。但仍然可以證明BHE分離純化后，大部分組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均有不同程度的提升。

2.3 純化組分抑制AGEs活性

2.3.1 純化組分在葡萄糖-BSA、果糖-BSA體系中的AGEs抑制率

圖3 葡萄糖-BSA體系中抑制AGEs活性Fig. 3 Inhibitory effect of BHE and its fractions on AGEs formation in glucose-BSA system

圖4 果糖-BSA體系中抑制AGEs活性Fig. 4 Inhibitory effect of BHE and its fractions on AGEs formation in fructose-BSA system

BSA與人血清白蛋白具有相似性，常用于評價體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)。分離純化組分在不同還原糖-BSA體系中抑制AGEs生成結(jié)果見圖3（葡萄糖-BSA）和圖4（果糖-BSA），BHE經(jīng)大孔樹脂兩次純化后除BHE-M1組分外，其他組分在葡萄糖-BSA、果糖-BSA兩個體系中顯示出極強(qiáng)的抑制AGEs活性，其中BHE-M4抑制活性最高。當(dāng)質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.200 mg/mL時BHE-M4抑制率分別為55.48%、57.16%、69.92%，分別高于同體系A(chǔ)G的抑制率22.85%、34.15%、60.40%；在果糖-BSA體系中各組分抗AGEs生成活性與葡萄糖-BSA體系中的趨勢一致，BHE-M4組分仍然顯示出較高的抑制活性，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.200 mg/mL時抑制率分別為47.23%、51.94%、72.33%，而同質(zhì)量濃度AG的抑制率分別為22.51%、38.42%、60.39%（圖4）。

常見天然植物的黃酮對蛋白非酶糖基化反應(yīng)普遍存在抑制作用[25-27]，如蘆薈的抑制率達(dá)到95%以上。蕎麥花總黃酮也能抑制體內(nèi)外蛋白質(zhì)非酶糖基化終產(chǎn)物的形成[28]。本實(shí)驗結(jié)果表明，BHE和PBHE及BHE-M組分均對蛋白質(zhì)非酶糖基化生成有較強(qiáng)的抑制作用，比AG更為顯著。

2.3.2 純化組分在MGO-BSA體系中的AGEs抑制率

除最常見的還原糖-BSA體系外，直接利用已知非酶糖基化反應(yīng)中生成的中間體，如MGO、乙二醛（glyoxal，GO）試劑作為提供羰基的試劑而建立的體系與葡萄糖或果糖的還原糖體系比較，該體系反應(yīng)時間更短，效率更高。研究表明蘆丁[29]、槲皮素[30]具有抑制MGO-BSA、GO-BSA、還原糖-BSA體系中AGEs形成的作用。本實(shí)驗以MGO作為提供羰基的試劑。質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL和0.050 mg/mL時，各組分對AGEs生成的抑制率分別在18.04%～23.34%和22.97%～32.47%范圍內(nèi)；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.200 mg/mL時，除BHE-M1、BHE-M5組分外其余組分顯示出較高的抑制AGEs生成活性，且與BHE-M1、BHE-M5組分有顯著性差異（圖5），其中質(zhì)量濃度0.200 mg/mL時BHE、BHE-M2、BHE-M3、BHE-M4組分抑制率分別達(dá)到53.64%、57.2%、57.38%、59.13%，較同質(zhì)量濃度AG分別高出4.89%、8.45%、8.63%、10.38%。

糖尿病的危害主要在于其高糖高脂引發(fā)的糖尿病并發(fā)癥。大量研究證實(shí)，引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的根本物質(zhì)是AGEs。研究表明，AGEs在糖尿病及其并發(fā)癥如糖尿病腎病[31]、動脈粥樣硬化[32]、糖尿病視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默癥[33]等疾病的發(fā)生以及發(fā)展過程中起著主要作用。已經(jīng)有報道證實(shí)，高AGEs飼料可促進(jìn)糖尿病鼠和正常鼠的腎功能惡化[34]，而苦蕎提取物具有抑制大鼠體內(nèi)蛋白非酶糖基化反應(yīng)的作用[35]。本實(shí)驗采用的3 個蛋白糖基化體系中除BHE-M1組分外，各組分均顯示出較強(qiáng)的抑制AGEs活性，其中BHE-M4組分活性最高，該組分也是黃酮類物質(zhì)富集的組分（圖1）。

2.4 BHE-M4組分黃酮類物質(zhì)分析

圖6 BHE-M4組分的總離子流圖（A）及化合物的正負(fù)離子質(zhì)譜圖（B）Fig. 6 Total ion chromatogram of BHE-M4 (A) and mass chromatograms of the compounds separated from it in positive and negative ion modes (B)

α-葡萄糖苷酶活力和抗蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物抑制率測定實(shí)驗結(jié)果顯示，黃酮含量高的組分即BHE-M4組其生物活性最高，因此采用HPLC-MS技術(shù)對BHE-M4組進(jìn)行成分分析。通過總離子流圖（圖6A）、正負(fù)離子質(zhì)譜圖（圖6B）共得到5 個化合物，對5 個化合物進(jìn)行推斷?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為449和447，推測分子質(zhì)量為448，m/z 287為[山奈酚＋H]＋，推測苷元為山奈酚，結(jié)構(gòu)中含有1 個半乳糖或者1 個葡萄糖。根據(jù)文獻(xiàn)[36]推斷該化合物為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷；化合物2：正負(fù)離子出峰m/z分別為433和431，推測該分子質(zhì)量為432，根據(jù)文獻(xiàn)[37]推斷該化合物為牡荊素?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為611和609，推測分子質(zhì)量為610，m/z 303為[槲皮素＋H]＋，推測苷元為槲皮素，結(jié)構(gòu)中含有1 個葡萄糖和1個鼠李糖，推測為蕓香糖（蘆丁糖）。根據(jù)文獻(xiàn)[36]推斷該化合物為蘆丁?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為465和463，推測分子質(zhì)量為464，m/z 303為[槲皮素＋H]＋，推測苷元為槲皮素，結(jié)構(gòu)中含有1 個葡萄糖和1 個半乳糖，根據(jù)文獻(xiàn)[38]推斷該化合物為異槲皮苷或金絲桃苷，異槲皮苷和金絲桃苷具有相同的苷元和相同分子質(zhì)量的糖，且總分子質(zhì)量相同，故暫時無法進(jìn)一步推斷。化合物5：正負(fù)離子出峰m/z分別為449和447，推測分子質(zhì)量為448，根據(jù)文獻(xiàn)[39]推斷該化合物為槲皮苷。

綜上，BHE-M4中主要黃酮類化合物可能為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、牡荊素、蘆丁、異槲皮苷或金絲桃苷、槲皮苷。

3 結(jié) 論

本研究將蕎麥殼提取物經(jīng)兩種型號大孔樹脂兩次純化后，分析各組分總黃酮含量、α-葡萄糖苷酶活力以及AGEs抑制率。得到的結(jié)論為高黃酮含量組分BHE-M4的α-葡萄糖苷酶活力抑制率以及AGEs抑制率最高。對BHE-M4組分繼續(xù)通過HPLC-MS進(jìn)行成分分析，共得到5 種可能的黃酮類化合物，分別為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、牡荊素、蘆丁、異槲皮苷或金絲桃苷、槲皮苷。對該組分進(jìn)一步進(jìn)行定性定量分析，確定其化學(xué)成分，將是未來的主要研究方向。

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