蒲 敏 羅紹蘭 廉小平 張賀翠 白曉璟 王玉奎 左同鴻高啟國 任雪松 朱利泉,*西南大學農學與生物科技學院, 重慶400700; 重慶市蔬菜重點實驗室, 重慶400700

自交不親和反應(self-incompatibility, SI)是植物在長期的進化過程中形成的防止自交衰敗、促進雜交優(yōu)勢的一種復雜而完善的遺傳機制。甘藍的自交不親和性主要是由于柱頭識別自花花粉后經復雜的信號傳導過程最終阻止花粉萌發(fā)及花粉管伸長, 有多種細胞間的信號系統(tǒng)參與[1-2]。目前研究最多的是由SRK-ARC1-Exo70A1等介導的蛋白質泛素化降解途徑, 即自花授粉后, 花粉中 S-位點半胱氨酸富集蛋白(SCR)與柱頭上S-位點受體激酶(SRK)的胞外域結合, 使其釋放原本結合在SRK激酶域的類硫氧還蛋白(THL1/THL2), 激活 SRK, 活化的 SRK磷酸化ARC1, 后者介導并通過泛素化過程降解 Exo70A1,直接或間接導致水孔蛋白(MOD)關閉, 柱頭細胞表面缺水,花粉因缺少水分等物質而不能正常萌發(fā), 從而實現(xiàn)SI反應[3-6]。但是, 深入研究表明, 通過反義抑制琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)柱頭中的 ARC1的表達只能部分打破自交不親和性, 而僅僅在擬南芥中轉入SRK和SCR基因后, 也能表現(xiàn)出自交不親和性, 這表明除ARC1外, 可能還存在其他的元件參與調控甘藍的自交不親和反應[7-8]。因此, 發(fā)現(xiàn)新的響應該過程的基因對研究甘藍的自交不親和性有重要意義。

本研究通過轉錄組測序分析甘藍自花和異花授粉后基因的表達情況, 篩選到一個受自花授粉強烈誘導表達的基因, 經生物信息學、組織表達特異性、授粉誘導表達模式等分析, 以期為進一步研究該基因在響應甘藍自花授粉過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

以西南大學十字花科蔬菜研究所選育的自交不親和甘藍高代自交系A4和F1植株為材料, 于2016年4月在開花前1～2 d將長勢相同的A4花蕾人工去雄, 用新鮮 F1花粉同時給去雄的 A4柱頭分別異花授粉0、15、30和60 min精細處理, 簡稱雜交(CP)組; 用新鮮A4花粉給去雄的A4柱頭同時分別自花授粉 0、15、30和 60 min精細處理, 簡稱自交(SI)組。到達處理時間后, 快速掃去柱頭上的花粉, 取下整個飽和授粉的花柱。選取長勢較好的甘藍植株,自花授粉30 min后在同一時間段分別取下花瓣、萼片、柱頭、葉片、雄蕊, 立即放入液氮中, 于–80oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉錄組測序及自花授粉特異序列的篩選

將自花授粉0、15、30和60 min和異花授粉0、15、30和60 min的甘藍柱頭送北京百邁克生物科技有限公司基于Illumina HiSeq測序技術平臺, 測序類型 PE150, 構建轉錄組文庫進行建庫測序, 獲得轉錄組數(shù)據(jù)。采用FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)來量化基因的表達水平[9-10], 計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。使用EBSeq進行差異表達分析, 以差異倍數(shù)Fold Change≥2或≤0.5及錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate) FDR＜0.01為篩選標準。根據(jù)基因在不同授粉處理后的相對表達量, 篩選在自花授粉后表達差異明顯、異花授粉后變化趨勢不大的基因。

1.3 特異序列基因的克隆

根據(jù)目的基因編碼區(qū)序列和 ClonExpress(Vazyme)快速克隆技術原理以及原核表達載體pGEX-4T-1 序列設計引物 GST–F/GST–R (表 1), 以甘藍A4柱頭cDNA和 gDNA為模板擴增序列, 在25 μL PCR 體系中依次加入 7.5 μL ddH2O, 12.5 μL 2× Phanta Max緩沖液, 上、下游引物各1 μL和模板cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶0.5 μL; 反應程序為 95oC 3 min; 95oC 15 s, 58oC 15 s,72oC 40 s, 共 35 個循環(huán); 72oC 延伸 5 min, 回收目的片段, 運用快速克隆技術將目的片段連接到pGEX-4T-1載體上后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α, 經菌液PCR篩選陽性克隆后送測序。

1.4 生物信息學分析

利用Bio-soft (http://www.bio-soft.net/sms/index.html)和DNAMAN8.0軟件推導基因編碼的氨基酸序列; 利用 ExPASy-ProtParam 在線工具(https://www.expasy.org/)分析蛋白的理化性質; 在 NCBI數(shù)據(jù)庫中通過 BlastN 比對, 檢索 BoSPI同源序列, 利用DNAMAN8.0進行多序列比對; 利用 SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)進行信號肽分析; 利用 T M H M M v 2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜域。用Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)、Swiss-model (https://swissmodel.expasy.org/)和InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)等在線軟件共同分析預測蛋白質的功能位點和高級結構域,用WOLF PSORT (http://www.genscript.com/wolfpsort.html)預測蛋白的亞細胞定位。通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子的順式作用元件。

表1 基因克隆及定量PCR中的引物Table 1 Primers used in gene cloning and RT-PCR

1.5 原核表達

將測序正確的原核表達菌株擴大培養(yǎng)后抽提重組質粒轉化表達菌株 E. coli BL21(DE3), 用引物GST-F/GST-R進行PCR檢測, 將陽性轉化子單克隆按1∶100擴大培養(yǎng), 振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～ 0.8,加入IPTG至終濃度為0.6 mmol L–1, 28oC誘導4 h后, 收集誘導的菌體, 超聲破碎后離心收集上清液,經海貍 GST融合蛋白純化磁珠純化目的蛋白, 用SDS-PAGE 電泳檢測, 然后用 GST雙抗體進行Western-blot定性檢測目的蛋白的表達。同時在試驗中設置以pGEX-4T-1空載為對照。

1.6 亞細胞定位表達分析

根據(jù) ClonExpress (Vazyme)快速克隆技術原理以及GFP融合表達載體pCAMBIA1300-GFP序列設計引物GFP-F和GFP-R (表1), 利用PCR技術擴增得到目的基因的片段。將擴增產物與pCAMBIA1300載體連接, 構建GFP融合蛋白的瞬時表達載體后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α, 篩選陽性克隆后送測序, 抽提重組質粒后轉化農桿菌GV3101, 同時作為空白對照, 注射煙草葉片經24 h暗培養(yǎng)后取侵染部位在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光以研究目的基因的亞細胞定位情況。

1.7 組織特異性表達分析

參照RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit說明書提取甘藍柱頭、葉片、雄蕊等組織的RNA, 參照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書反轉錄合成cDNA, 于–20oC保存?zhèn)溆?。利用半定量PCR技術檢測目的基因的組織表達模式, 分別以甘藍葉片、柱頭、萼片、雄蕊和花瓣的 cDNA為模板, 以RT-F/RT-R (表1)為引物, 用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶25 μL反應體系檢測目的基因在上述組織中的表達情況。反應程序為95oC 3 min; 95oC 15 s, 60oC 15 s, 72oC 30 s, 共 30 個循環(huán);72oC延伸5 min。同時以Actin3為內參基因(表1)。PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測。

1.8 授粉誘導表達分析

以經不同授粉處理的柱頭 cDNA為模板, 參照SYBR Premix Ex Taq說明書, 以 Actin3為內參,RT-F/RT-R (表 1)為引物, 用 7500型實時熒光定量PCR儀擴增。反應體系為20 μL, 含2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL, 引物各 1 μL, cDNA 模板 1 μL, 加超純水至 20 μL。擴增程序為95oC預變性1 min; 95oC 15 s, 60oC 15 s, 72oC 30 s, 共 40 個循環(huán)。設置每個試驗 3次重復, 采用 2–ΔΔCT法計算目的基因的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數(shù)據(jù)分析及BoSPI基因的確定

共獲得 60.25 Gb Clean Data, 各樣品的 Clean Data均達到7.31 Gb, Q30堿基百分比在93.06%及以上, 可認為測序質量可靠。篩選到一個受自花授粉誘導大量上調表達的基因序列, 其表達量在 0 min約為 46.5, 在自花授粉 30 min后達到 544.8, 相差11.7倍多, 而異花授粉后變化不大(圖 1), 表明該基因的表達可能受自花授粉誘導, 命名為BoSPI。

2.2 甘藍BoSPI基因的克隆與生物信息學分析

以A4柱頭cDNA和gDNA為模板, PCR擴增均得到約 550 bp的產物(圖 2), 表明該基因不含內含子。經測序分析得到長度為 534 bp的編碼閱讀框,與文庫所得序列一致, 編碼含 177個氨基酸殘基的蛋白質(圖 3), 該蛋白質相對分子質量約為 17 kD,理論 pI為 4.21。帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為29, 帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為13; 不穩(wěn)定系數(shù)為 39.79, 小于 40, 因此為穩(wěn)定蛋白。平均親水性系數(shù)為–0.37, 推測為親水性蛋白,BoSPI蛋白可能定位于胞質。

圖1 經轉錄組測序分析甘藍柱頭內BoSPI響應自花和異花授粉后的表達情況Fig. 1 Expression pattern of BoSPI in stigma of cabbage in response to self and cross pollination by transcriptome technology

圖2 甘藍BoSPI基因cDNA和gDNA序列擴增Fig. 2 Amplification of BoSPI gene from cDNA and gDNA of the stigma of cabbage

BoSPI蛋白含有4個保守的EF-hand結構域, 分別位于第 23～51、第 59～87、第 92～120、第 128～156位氨基酸殘基位置處(圖 3); Ca2+結合的核心區(qū)域分別位于第 32～44、第 68～80、第 101～113、第 137～149位氨基酸殘基, 其特點是由12個氨基酸殘基組成的α-螺旋環(huán)結構, 其中的第1、第3、第6和第12位氨基酸殘基較為保守, 且第 6位多為 Gly, 在這 12個殘基的前一位氨基酸(第 0位氨基酸)為疏水性氨基酸殘基, 由第1、第3、第5、第7、第9和第12位氨基酸殘基分別按照 X、Y、Z、-Y、-X和-Z空間排列形成五邊形雙錐結構, 第 12位保守的 Glu或Asp 的 2個氧原子與 Ca2+以雙齒配體的方式結合,使 EF-hand結構域的構象改變, 最終導致靶蛋白的激活或者失活[11-13], 說明該基因可能參與 Ca2+信號調控。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BlastN比對, 發(fā)現(xiàn)BoSPI與甘藍 CML27和甘藍 CML26序列同源性分別為96%和72%, BoSPI與CML27共有7個核苷酸位點不同, 其中5個位點又與CML26相同(圖4), 最終導致 6個氨基酸發(fā)生變化, 其中有 4個氨基酸殘基位于鈣離子結合的核心區(qū)域。

利用甘藍基因組(http://brassicadb.org/brad/index.php)及PlantCARE啟動子分析軟件在位于BoSPI基因起始密碼子上游 2000 bp的核苷酸序列中預測到真菌誘導響應、代謝調節(jié)以及器官形成等多種順式作用元件(表 3), 表明該基因除了能響應授粉刺激,還可能響應其他多種信號。

2.3 甘藍BoSPI基因的原核表達和原位表達

圖3 BoSPI基因序列及其推導的氨基酸序列(A)、Ca2+結合核心結構分析(B)和BoSPI蛋白三維結構預測(C)Fig. 3 BoSPI cDNA sequence and deduced amino acid sequence (A), analysis of the core area of calcium ion binding (B) and predicted three-dimensional structure (C) for BoSPI protein

構重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株 E. coli BL21 (DE3), 提取總蛋白后經過海貍GST融合蛋白純化磁珠純化, 后經SDS-PAGE電泳和Western-blot GST雙抗孵育后顯色驗證, 得到GST-BoSPI的單一條帶, BoSPI原核表達的GST融合蛋白大小約為43 kD, 與BoSPI編碼蛋白質的相對分子質量大小一致(圖5)。其中pGEX-4T-1空載體表達約26 kD的蛋白,BoSPI預測分子大小約為 17 kD, 二者融合約為 43 kD的蛋白。將重組質粒 BoSPI-GFP轉化農桿菌GV3101, 注射煙草后在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光。對照為無定位功能的 GFP蛋白,BoSPI-GFP融合蛋白綠色熒光主要出現(xiàn)在細胞膜和細胞質區(qū)域(圖 6)。上述證據(jù)表明, BoSPI是一種天然蛋白, 位于細胞膜和細胞質區(qū)域。

圖4 BoSPI及其同源序列關系分析Fig. 4 Phylogenetic relationship of nucleotide sequence between BoSPI and its homologous genes

2.4 甘藍BoSPI基因的表達分析

甘藍A4自花30 min授粉后, 葉片、柱頭、萼片、雄蕊和花瓣中 BoSPI基因均有轉錄, 其 cDNA帶譜顯示柱頭中表達量最高(圖7)。

表3 BoSPI基因上游調控區(qū)順式作用元件Table 3 cis-elements in the upstream regulation region of BoSPI gene

圖5 BoSPI蛋白的原核表達Fig. 5 Prokaryotic expression protein analysis of BoSPI protein

圖6 BoSPI-GFP融合蛋白的亞細胞定位Fig. 6 Subcellular localization of BoSPI-GFP protein in tobacco cell

圖7 BoSPI基因在甘藍不同組織中的表達分析Fig. 7 Expression analysis of BoSPI in different organs of Brassica oleracea L. var. capitata

圖8 BoSPI基因在不同授粉處理中的表達。Fig. 8 Expression level of BoSPI in response to self and cross pollination

利用熒光定量PCR分析了BoSPI基因在不同授粉處理后的柱頭中的表達情況, 結果表明, BoSPI基因在經自花和異花授粉后表達趨勢均先上調后下調,在自花授粉后變化更明顯, 自花授粉30 min后的相對表達量約為20.07, 異花授粉30 min后的相對表達量約為 8.02, 前者明顯高于后者而且相差 2.5倍(圖8), 自花授粉 30 min后正是 SI反應的關鍵時期,BoSPI基因在該時間點上對自花授粉發(fā)生反應, 且相差 2倍以上, 這進一步驗證自花授粉能強烈誘導該基因在甘藍柱頭中的表達, 表明 BoSPI基因響應甘藍自花授粉后的反應。

3 討論

本研究基于以自交不親和甘藍經不同授粉處理后的轉錄組文庫, 篩選出一個受自花授粉誘導顯著上調表達的基因(BoSPI), 授粉誘導表達分析表明自花授粉30 min后的相對表達量約為20.07, 約為授粉0 min的19倍; 而異花授粉30 min后的相對表達量約為8.02, 前者明顯高于后者且相差2.5倍, 說明自花授粉能顯著誘導該基因的表達。BoSPI基因在柱頭中的表達量明顯高于其他部位, 甘藍自交不親和反應主要在自花授粉后的柱頭中發(fā)生, 進一步表明該基因可能參與自花授粉后柱頭中的復雜反應過程。BoSPI-GFP融合蛋白綠色熒光主要出現(xiàn)在細胞膜和細胞質區(qū)域, 與相關基因的研究結果一致[14-15]。BoSPI基因的啟動子區(qū)域含有真菌誘導響應、代謝調節(jié)以及器官形成等多種順式作用元件, 表明BoSPI基因可能參與調控復雜的生物反應過程, 特別值得關注的是, 如果真菌誘導響應的最終結果是抑制真菌, 那么SI最終導致自花被抑制的現(xiàn)象就同真菌被抑制存在某種聯(lián)系。

BoSPI蛋白質含有4個保守的EF-hand結構域,表明該基因可能參與Ca2+信號調控。在植物中, Ca2+信號廣泛參與調控花粉管及花的發(fā)育、植物應激和肌動蛋白絲的運動等, 這些都可能與植物的自交不親和反應過程相關[16-21]。Dearnaley等[22]發(fā)現(xiàn)親和授粉與不親和授粉后在柱頭乳突細胞的細胞質和細胞壁中的鈣離子流與乳突細胞接觸花粉粒細胞區(qū)域有關。在油菜中發(fā)現(xiàn)胞質內的鈣峰與后續(xù)花粉粒的水合相對應[23-24]。在罌粟的自交不親和現(xiàn)象中, 花粉與柱頭特異性識別后, 大量外源 Ca2+流入自交不親和性花粉管, 擾亂花粉管內 Ca2+濃度梯度, 進而抑制花粉管的正常生長, 同時紊亂的 Ca2+濃度梯度誘導微絲骨架解聚, 最終導致花粉管的程序性死亡[25-26]。Iwano等[27]觀察自交不親和擬南芥柱頭乳突細胞的鈣離子濃度發(fā)現(xiàn), 與親和授粉相比, 在自花授粉后柱頭內 Ca2+濃度顯著上升使花粉管不能正常伸長最終打破自交不親和性, 這種 Ca2+濃度的顯著上升與相同單倍型的SRK與SCR/SP11特異識別相關聯(lián), 表明Ca2+信號也參與調控甘藍的自交不親和性。

BoSPI基因自花授粉后顯著的上調表達, 在 30 min后達到最高, 而異花授粉變化不大, 且自花、異花倍數(shù)相差2倍以上, 自花授粉30 min后正是SI反應的關鍵時期, BoSPI基因在該時間點上對自花授粉發(fā)生反應, 可能跟自花授粉后相同單倍型的SRK與SCR/SP11特異識別后的 Ca2+濃度的顯著上升有關,推測該基因可能作為 Ca2+信號元件參與甘藍自花授粉后的反應過程。在今后的研究中, 我們將利用超表達和基因沉默等技術進一步驗證該基因的功能及其作用機制。

4 結論

從甘藍轉錄組文庫篩選并克隆一個受自花授粉誘導上調表達的基因 BoSPI, 該基因的開放閱讀框為 534 bp, 編碼 177個氨基酸, 含有 4個保守的EF-hand結構域, 其編碼蛋白大小為 17 kD。BoSPI蛋白分布于細胞膜和細胞質。BoSPI基因主要在柱頭表達, 在花瓣、萼片、葉片和雄蕊中亦有表達。甘藍自花授粉30 min后, BoSPI基因水平顯著上調。初步推斷BoSPI參與了柱頭響應自花花粉刺激的分子過程, 可能是實現(xiàn)甘藍自交不親和性相關的某種新功能基因。

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