戴 榕， 王 超， 周 軍， 段剛峰， 劉纓紅， 鄭瓊莉

(武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 湖北 武漢 430030)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種常見的心血管疾病。由于該病可引起心肌舒縮功能發(fā)生障礙，常常導(dǎo)致心排血量不足，從而引起循環(huán)功能發(fā)生障礙，其病情往往發(fā)展快，且預(yù)后較差，是最終導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的最主要原因之一[1]。相關(guān)研究顯示，慢性心力衰竭的患病率在1%以上[2]，且多發(fā)于老年人，65歲以上人群慢性心力衰竭的患病率高達(dá)6%[3]，因此，對(duì)慢性心力衰竭的防治研究就顯得極其重要。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在維持機(jī)體內(nèi)水、電解質(zhì)及血壓平衡過程中具有重要作用，其在慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用[4]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是近些年來新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，其具有舒張血管、抑制細(xì)胞增殖和抑制血小板聚集等多種生物學(xué)效應(yīng)，并參與了心血管系統(tǒng)正常生理功能以及多種病理生理過程的調(diào)控[5]。因此，本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立CHF大鼠模型，探討H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)對(duì)CHF大鼠心功能以及心臟RAAS系統(tǒng)活性的影響，從而探討其改善慢性心力衰竭大鼠心功能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠共40只，體重(230±20)g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018，所有大鼠在SPF級(jí)12 h明暗交替的環(huán)境下飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

硫氫化鈉購自Promega；qPCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa；腎素(renin)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和醛固酮(aldosterone，ALD)ELISA試劑盒均購自Bio-Swamp；小鼠抗人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抗體(貨號(hào)ab11734，稀釋比1∶100)、小鼠抗人血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)抗體(貨號(hào)ab9391，稀釋比1∶400)、小鼠抗兔GAPDH抗體(貨號(hào)ab8245，稀釋比1∶500)和山羊抗小鼠IgG II 抗(貨號(hào)ab6789，稀釋比1∶2 000)均購自Abcam。高速離心機(jī)購自Eppendorf；電泳儀購自Bio-Rad；熒光定量PCR儀購自Roche；超聲心動(dòng)圖儀購自Siemens。

3方法

3.1造模及分組 在40只SD大鼠中隨機(jī)挑選10只作為假手術(shù)(sham)組，另30只大鼠通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)構(gòu)建CHF模型，其方法如下：術(shù)前禁食24 h，手術(shù)當(dāng)日大鼠稱重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)麻醉大鼠，在劍突下腹部正中切開皮膚2～3 cm，將腹腔打開，在左腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，穿過1條0號(hào)絲線，將去尖磨鈍的7號(hào)手術(shù)針置于絲線處，結(jié)扎絲線后抽取手術(shù)針，檢查腹主動(dòng)脈通暢后關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠僅分離腹主動(dòng)脈但不做結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后均給予青霉素20萬單位進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)3 d。大鼠術(shù)后正常飼養(yǎng)4周，以左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

術(shù)后4周，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型(model)組、NaHS高劑量(high dose of NaHS)組和NaHS低劑量(low dose of NaHS)組，每組6只。其中NaHS高劑量組和NaHS低劑量組大鼠分別按照14 μmol·kg-1·d-1和2.8 μmol·kg-1·d-1的劑量腹腔注射NaHS，模型組以等量生理鹽水代替，連續(xù)治療30 d。

3.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能 通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)每組大鼠治療前及治療結(jié)束后的心功能情況，以30 mL/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，分別測(cè)量左心室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)以及LVEF。

3.3血漿中腎素、血管緊張素Ⅱ及醛固酮濃度檢測(cè) 治療結(jié)束后，以30 mL/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈插管取血和心肌組織待測(cè)。心臟取血3 mL，2 000×g離心15 min后，取血漿300 μL，分別采用renin、AngⅡ和ALD ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血漿中renin、AngⅡ以及ALD的濃度，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.4qPCR檢測(cè)心肌組織中ACE和AT1R的mRNA表達(dá) 取各組大鼠心肌組織，按照Trizol法提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度，將總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)qPCR反應(yīng)引物，以GAPDH作為內(nèi)參照。ACE的正向引物序列為5’-TTGACATGAGCAAGTTCCTG-3’，反向引物序列為5’-CAAATCAGACTCGAGTGGCA-3’；AT1R的正向引物序列為5’-GCAATGGTCGGGACATAGTT-3’，反向引物序列為5’-AGACCTGACTTGGCAGAGGA-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-GTCGTAGCAAACCACCAAGC-3’，反向引物序列為5’-TGTGGGTGAGGAGCACATAG-3’。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，按照2-ΔΔCt計(jì)算ACE和AT1R的相對(duì)表達(dá)量。

3.5Western blot檢測(cè)心肌組織中ACE和AT1R蛋白的表達(dá) 取保存于-80 °C的各組大鼠心肌組織100 mg左右在液氮下碾碎，采用RIPA裂解液提取各組心肌組織蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣30 μL蛋白樣品，采用12% SDS-PAGE進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃下孵育過夜，TBST再次洗滌后，加入特異性 II 抗，進(jìn)行室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)其曝光顯影，拍照保存。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，同組間治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠治療前后心功能指標(biāo)比較

治療前，與假手術(shù)組相比，模型組、NaHS低劑量組和NaHS高劑量組的LVEDD和LVESD均明顯升高，而LVEF明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過NaHS治療后，與模型組和治療前相比，NaHS低劑量組和NaHS高劑量組的LVEDD和LVESD明顯降低，而LVEF明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NaHS低劑量組相比，NaHS高劑量組的LVEDD和LVESD降低，而LVEF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2各組大鼠血漿中renin、AngⅡ和ALD濃度的比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿中renin、AngⅡ和ALD濃度均顯著升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，NaHS低劑量組和NaHS高劑量組的renin、AngⅡ和ALD濃度顯著降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NaHS高劑量組的renin、AngⅡ和ALD濃度顯著低于NaHS低劑量組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠治療前后心功能指標(biāo)比較

*P<0.05vssham group before treatment;▲P<0.05vsthe same group before treatment;#P<0.05vsmodel group after treatment;△P<0.05vslow dose of NaHS group after treatment.

表2 各組大鼠血漿中renin、AngⅡ及ALD濃度比較

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vslow dose of NaHS group.

3各組大鼠心肌組織中ACE和AT1RmRNA的表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中ACE和AT1R的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過NaHS治療后，與模型組相比，NaHS高劑量組和NaHS低劑量組ACE和AT1R的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NaHS低劑量組相比，NaHS高劑量組ACE和AT1R的mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

4各組大鼠心肌組織中ACE和AT1R蛋白的表達(dá)

模型組大鼠心肌組織中ACE和AT1R的蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過NaHS治療后，與模型組相比，NaHS高劑量組和NaHS低劑量組ACE和AT1R的蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NaHS低劑量組相比，NaHS高劑量組ACE和AT1R的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The mRNA expression of ACE (A) and AT1R (B) in the myocardium tissue of rats in each group was detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vslow dose of NaHS group.

圖1qPCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織中ACE和AT1R的mRNA表達(dá)

Figure 2. The expression of ACE (A) and AT1R (B) at protein levels in the myocardium tissue of rats in each group was detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vslow dose of NaHS group.

圖2Westernblot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中ACE和AT1R蛋白的表達(dá)

討 論

慢性心力衰竭是由多種病因引起心室重構(gòu)、心肌舒張或收縮功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致心排血量減少的心血管疾病的終末階段，是導(dǎo)致心血管病患者死亡的重要原因之一[6]。已有研究表明，心力衰竭時(shí)機(jī)體往往會(huì)過度激活RAAS，尤其是心臟出現(xiàn)局部RAAS的過度活化在慢性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著尤其重要的作用，發(fā)生心力衰竭時(shí)有效抑制RAAS的活化，對(duì)于改善心力衰竭心功能具有重要意義[7]。因此，研究心力衰竭發(fā)生時(shí)如何抑制RAAS的過度激活是防治心力衰竭的重要措施之一。

本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立CHF大鼠模型，術(shù)后4周采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能，其中模型組大鼠的LVEF≤45%，即表明CHF大鼠模型造模成功。隨后我們采用2個(gè)劑量的NaHS對(duì)CHF大鼠進(jìn)行治療，再通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠的心功能，結(jié)果表明，與治療前比較，治療后NaHS低劑量組和NaHS高劑量組的LVEDD和LVESD明顯降低，而LVEF明顯升高；與NaHS低劑量組相比，NaHS高劑量組的LVEDD和LVESD降低，而LVEF升高。此結(jié)果提示NaHS能顯著改善CHF大鼠心功能，且高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。NaHS是H2S的供體，外源性NaHS進(jìn)入體內(nèi)后可解離成硫氫根離子和鈉離子，其中硫氫根離子與機(jī)體內(nèi)的氫離子相結(jié)合成H2S，使得體內(nèi)NaHS和H2S形成動(dòng)態(tài)平衡[8]。H2S是近些年來新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，其具有舒張血管、抑制細(xì)胞增殖和抑制血小板聚集等多種生物學(xué)效應(yīng)，并參與了心血管系統(tǒng)正常生理功能以及多種病理生理過程的調(diào)控[5]。已有研究證實(shí)NaHS可顯著改善心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷男募∈湛s和舒張功能，對(duì)損傷心肌具有一定的保護(hù)作用[9]。李曉慧等[10]的研究表明NaHS可改善CHF大鼠的心肌纖維損傷，進(jìn)而有效改善CHF大鼠心功能及心臟結(jié)構(gòu)，與本研究結(jié)果基本一致。

RAAS主要由renin、AngⅡ和ALD等組成，其中ACE可促進(jìn)renin轉(zhuǎn)化為AngⅡ后進(jìn)一步與AT1R結(jié)合，促進(jìn)心肌纖維化及心肌肥大等生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿中renin、AngⅡ和ALD濃度顯著升高，且心肌組織中ACE和AT1R的mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高，表明發(fā)生慢性心力衰竭時(shí)RAAS活性出現(xiàn)過度激活。發(fā)生心力衰竭時(shí)機(jī)體腎血流量減少，使腎小球旁細(xì)胞分泌renin增多，進(jìn)而促進(jìn)AngⅡ的分泌，AngⅡ可使外周血管的收縮增強(qiáng)，減少組織器官血液灌流，進(jìn)而引起心肌及心肌間質(zhì)細(xì)胞代謝功能發(fā)生改變，促進(jìn)心室重構(gòu)，影響心臟的舒張和收縮功能[11]。李艷等[12]的研究表明芪藶強(qiáng)心膠囊可通過降低CHF大鼠的氧化應(yīng)激水平，抑制RAAS活性，從而有效改善CHF大鼠的心功能。本研究中，與模型組相比，NaHS低劑量組和NaHS高劑量組血漿中renin、AngⅡ和ALD濃度顯著降低，心肌組織中ACE和AT1R的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降，且NaHS高劑量組的效果優(yōu)于NaHS低劑量組，表明NaHS可有效抑制RAAS的活性，且高劑量效果優(yōu)于低劑量。

[1] Ul Haq MA, Wong C, Hare DL. Heart failure with preserved ejection fraction: an insight into its prevalence, predictors, and implications of early detection[J]. Rev Cardiovasc Med, 2015, 16(1):20-27.

[2] Sungwon C, Davidson PM, Newton PJ, et al. Composite outcome measures in a pragmatic clinical trial of chronic heart failure management: a comparative assessment[J]. Int J Cardiol, 2015, 185(1):62-68.

[3] Coles AH, Fisher KA, Darling C, et al. Recent trends in post-discharge mortality among patients with an initial acute myocardial infarction[J]. Am J Cardiol, 2012, 110(8):1073-1077.

[4] Pitt B, Bakris GL, Bushinsky DA, et al. Effect of patiromer on reducing serum potassium and preventing recurrent hyperkalaemia in patients with heart failure and chronic kidney disease on RAAS inhibitors[J]. Eur J Heart Fai-lure, 2015, 17(10):1057-1065.

[5] 潘禮龍, 劉新華, 朱依諄. 硫化氫在心血管保護(hù)過程中免疫炎癥調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2017, 48(1):30-36.

[6] 王學(xué)惠, 劉慧兵, 趙國安. 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β聯(lián)合卡托普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2017, 33(3):417-422.

[7] Mori J, Zhang L, Oudit GY, et al. Impact of the renin-angiotensin system on cardiac energy metabolism in heart failure[J]. J Mol Cell Cardiol, 2013, 63(10):98-106.

[8] Hosoki R, Matsuki N, Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 237(3):527-531.

[9] Su YW, Liang C, Jin HF, et al. Hydrogen sulfide regulates cardiac function and structure in adriamycin-induced cardiomyopathy[J]. Circ J, 2009, 73(4):741-749.

[10] 李曉惠, 張超英, 張 霆. 硫氫化鈉對(duì)慢性心力衰竭大鼠心功能及心臟結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 91(43):3044-3049.

[11] Zucker IH, Xiao L, Haack KK. The central renin-angiotensin system and sympathetic nerve activity in chronic heart failure[J]. Clin Sci, 2014, 126(10):695-706.

[12] 李 艷, 金小軍. 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心力衰竭大鼠心臟腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性的影響[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2016, 10(2):238-242.