譚秋嬋， 陳湛如， 俞美聲 ， 梁協(xié)稠， 趙 嬋 ， 高 宏， 鄭衍芳， 伍嘉寶， 朱林燕， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)系， 2藥理學(xué)系， 廣東 廣州 510632； 3廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所， 廣東 廣州 510600)

甲狀腺激素對(duì)人體發(fā)育以及代謝起著重要的調(diào)控作用。碘(I)是甲狀腺激素合成不可缺少的原材料，甲狀腺含碘量占全身總碘量的90%。碘以碘離子(I-)的形式存在于血液中，I-從血液進(jìn)入甲狀腺合成甲狀腺激素經(jīng)歷了一系列轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程?，F(xiàn)已被公認(rèn)，甲狀腺細(xì)胞基底膜的碘離子攝取是由鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter，NIS)特異性介導(dǎo)的[1]。甲狀腺激素合成的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是I-從甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞流入濾泡腔中參與甲狀腺球蛋白碘化，有研究指出，該過(guò)程是多種轉(zhuǎn)運(yùn)體和陰離子通道等共同作用的結(jié)果，氯通道也可能參與I-排出的過(guò)程[2-3]。

電壓門控氯離子通道(voltage-gated chloride channel，ClC) 由CLCN基因編碼，ClC-3是ClC家族中的一員，廣泛分布于腦、腎、心臟、骨骼肌和腺體組織，在質(zhì)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞器上都有表達(dá)。我們前期對(duì)ClC-3氯通道做了一系列研究, 證明該通道受多種因素調(diào)控，參與了細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、 周期調(diào)節(jié)和凋亡等多種生理活動(dòng)[4-6]。我們?cè)趯?duì)ClC-3氯通道的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其對(duì)陰離子選擇性并不高，陰離子通透性大小表現(xiàn)為I->Br->Cl-> 葡萄糖酸根[7-8]，提示ClC-3很有可能參與了甲狀腺I-的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而影響甲狀腺激素的合成與分泌， 但是ClC-3對(duì)甲狀腺的影響目前還未見報(bào)道。 本研究擬構(gòu)建ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠，探討ClC-3的表達(dá)與甲狀腺結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠委托Cyagen Biosciences構(gòu)建，動(dòng)物合格編號(hào)為TGS120401AH01，小鼠品系為FVB，F(xiàn)VB野生型(wild type，WT)小鼠為本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠在SPF級(jí)環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，室溫為(22±2)℃，濕度為60%～80%，12 h晝夜交替照明，隔日更換墊料，自由攝食攝水。

2主要試劑

引物由生工生物工程有限公司合成，見表1；Prime ScriptTMRT Reagent Kit購(gòu)自TaKaRa；2×Tap PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；兔抗小鼠ClC-3多克隆抗體購(gòu)自Abcam；小鼠總?cè)饧谞钕僭彼?total triiodothyronine，TT3)、小鼠總甲狀腺素(total thyroxine，TT4)和小鼠促甲狀腺素(thyrotropin，TSH) ELISA試劑盒均購(gòu)自Bio-Swamp。

3主要方法

3.1ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定 剪取3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠尾尖0.4 cm～0.6 cm，采用苯酚抽提法提取基因組DNA，行PCR反應(yīng)擴(kuò)增ClC-3基因。引物序列見表1。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)采集結(jié)果。在440 bp出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的小鼠分組到ClC-3高表達(dá)組中，出現(xiàn)陰性條帶的小鼠則舍棄。

3.2標(biāo)本的采集 對(duì)3月齡的WT小鼠和經(jīng)鑒定為ClC-3高表達(dá)的小鼠進(jìn)行行為學(xué)監(jiān)測(cè)，稱重后測(cè)量肛溫，摘取眼球采血后處死。取出甲狀腺組織后稱重并常規(guī)行HE染色觀察其結(jié)構(gòu)的變化。

表1 引物序列

3.3qPCR檢測(cè)甲狀腺ClC-3 mRNA的表達(dá) 苯酚法提取甲狀腺組織總RNA，于微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的A260/A280，其值在1.9～2.1表明純度較好。 參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，參照北京天根公司2×Tap PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qPCR檢測(cè)。引物序物見表1。

3.4Western blot檢測(cè)小鼠甲狀腺ClC-3蛋白的表達(dá) 收集甲狀腺組織，按50 g/L 加入RIPA裂解液，冰上勻漿30 min，4℃、 12 000×g離心10 min,取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備7% SDS-PAG，電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，兔抗小鼠ClC-3Ⅰ抗(1∶800) 4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG( 1∶5 000) 37℃孵育1 h，洗滌后于凝膠成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。

3.5免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠甲狀腺ClC-3的表達(dá)和分布 甲狀腺組織經(jīng)多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋后切片。石蠟切片經(jīng)60 ℃烘片24 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水；0.1 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸液修復(fù)， 0.3 % Triton X-100透膜，10 %綿羊血清封閉；ClC-3Ⅰ抗(1∶50)4℃孵育過(guò)夜；Cy3標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶100)室溫避光孵育1 h；5 mg/L的DAPI室溫下染色5 min；激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.6ELISA法測(cè)小鼠TT3、TT4和TSH 摘取小鼠眼球收集血液，室溫自然凝固30 min，1 000 ×g離心15 min，收集上清。按Bio-Swamp ELISA試劑盒說(shuō)明操作，450 nm 波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的A值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的A值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用t檢驗(yàn)方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

本研究中構(gòu)建ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)入質(zhì)粒為pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3> IRES/eGFP。采用PCR檢測(cè)鼠尾組織并鑒定。在瓊脂糖凝膠上，轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)出現(xiàn)440 bp的條帶，野生型小鼠則在此不會(huì)出現(xiàn)條帶，200 bp處顯示內(nèi)參照條帶，見圖1。

2ClC-3轉(zhuǎn)基因和WT小鼠甲狀腺ClC-3的表達(dá)差異

通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)2組小鼠甲狀腺中ClC-3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠ClC-3的表達(dá)量都高于野生型小鼠(P<0.05)。通過(guò)免疫熒光觀察2組小鼠甲狀腺ClC-3的表達(dá)與分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組小鼠中均觀察到被紅色熒光標(biāo)記的ClC-3，主要分布在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的胞膜上，ClC-3轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)量明顯較高，見圖2。

Figure 1. PCR was performed with DNA extracted from the tail of 3-weeks-old FVB mice.

圖1PCR鑒定ClC-3高表達(dá)小鼠

Figure 2. ClC-3 expression and distribution in the thyroid gland from wild type andClC-3 transgene mice. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

圖2野生型和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺ClC-3的表達(dá)與分布

3ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺形態(tài)及結(jié)構(gòu)的改變

大體形態(tài)上，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺相比野生型小鼠的更大，組織明顯充血，見圖3A；稱量結(jié)果顯示，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺重量普遍增加(P<0.05)，見圖3B。HE染色結(jié)果顯示， 野生型小鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞多為單層立方或扁平狀，甲狀腺濾泡腔多為中等大小，濾泡腔內(nèi)充滿紅染膠質(zhì)；而ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠濾泡上皮細(xì)胞明顯腫大，增生變化明顯，細(xì)胞呈高柱狀改變，甲狀腺濾泡腔大小差異較大，部分甲狀腺濾泡腔增大，膠質(zhì)增多，見圖3C。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與野生型小鼠甲狀腺濾泡腔面積相比，高表達(dá)組濾泡腔平均面積明顯較大 (P<0.05)，見圖3D。

Figure 3. Transgene mice have morphologic and histologic changes in the thyroid gland. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

圖3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

4ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠體重、肛溫及行為表現(xiàn)的改變

與野生型小鼠相比，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠體型略小,體重偏低(P<0.05)；肛溫較高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 攝食量也明顯增大(P<0.05)，飲水量未見明顯差異，見表2。行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，大部分ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠活動(dòng)較頻繁、易激怒、好斗、毛須豎起，甚至脫落。總體表現(xiàn)與甲亢高代謝癥候群相似。

表2野生型小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠體重、肛溫、飲水量以及攝食量的測(cè)量

Table 2. Detection of weight, anal temperature, water intake and food consumption of WT andClC-3 transgene mice(Mean±SD.n=20)

GroupWeight(g)Analtemperature(℃)Waterintake(mL)Foodconsumption(g)WT28．16±0．6536．35±0．124．37±0．234．59±0．32ClC?3transgene25．32±1．03?36．72±0．214．23±0．316．38±0．58?

*P<0.05vsWT group.

5ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的TT3、TT4和TSH的改變

ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠血清中TT3和TT4平均濃度均明顯高于野生型小鼠(P<0.05)；雖然ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠TSH濃度與野生型小鼠的濃度不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠TSH濃度有降低的趨勢(shì)，見圖4。

Figure 4. Detection of serum TT4, TT3 and TSH concentrations inClC-3 transgene mice and WT mice. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsWT group.

圖4野生型和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的TT4、TT3和TSH的表達(dá)

討 論

氯通道是體內(nèi)最主要的陰離子通道，氯通道有多種不同類型，包括鈣激活氯通道、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator， CFTR)氯通道、電壓依賴性氯通道和容積敏感氯通道等，它介導(dǎo)體內(nèi)最多的陰離子-Cl-順電-化學(xué)梯度被動(dòng)擴(kuò)散。氯通道在甲狀腺中的作用近來(lái)受到重視。CFTR在甲狀腺上有表達(dá)，并且可能與濾泡增生相關(guān)[9]，囊性纖維化病人(CFTR基因缺陷)存在亞臨床甲狀腺功能減退[10]。鈣激活性氯通道ANO1主要分布在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的頂膜上，可能介導(dǎo)頂膜的I-流出[11]。ClC-5是ClC氯通道家族中的一個(gè)亞型，其缺失可導(dǎo)致I-外流延遲，并且可導(dǎo)致TSH和T4正常的甲狀腺腫[12]。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人甲狀腺細(xì)胞表達(dá)ClC氯通道家族ClC-1～ClC-7的mRNA中 ClC-3表達(dá)最高，是ClC-5的10多倍，那ClC-3是否影響著甲狀腺的結(jié)構(gòu)和功能呢？

本課題組在對(duì)ClC-3氯通道的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ClC-3通道開放時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)有較明顯外向整流、無(wú)時(shí)間依賴性和電壓依賴性失活、對(duì)容積改變敏感的氯電流，該通道對(duì)I-的通透性大于Cl-， 提示ClC-3很有可能參與了甲狀腺I-轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而影響甲狀腺激素合成與分泌。

與WT組小鼠相比，ClC-3轉(zhuǎn)基因組小鼠甲狀腺ClC-3表達(dá)明顯增多,且主要分布在細(xì)胞膜上。ClC-3氯通道主要介導(dǎo)陰離子順著濃度梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是對(duì)I-的通透性最為明顯，因而我們推測(cè)ClC-3很可能參與了細(xì)胞內(nèi)高碘的甲狀腺細(xì)胞的碘外排。

形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠傾向于發(fā)生甲狀腺增生肥大，濾泡上皮細(xì)胞增生肥大，呈高柱狀改變，濾泡腔明顯增大。這可能是由于ClC-3高表達(dá)后，促進(jìn)了碘的外排，更多的碘離子外排到濾泡腔內(nèi)，甲狀腺球蛋白碘化增多，一方面導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞中甲狀腺球蛋白合成增多，細(xì)胞體積增大；另一方面導(dǎo)致大量的碘化甲狀腺球蛋白堆積在濾泡腔內(nèi)，濾泡腔增大，最終導(dǎo)致小鼠甲狀腺組織增生肥大。

日常行為表現(xiàn)和體征研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠行為表現(xiàn)與甲亢的的高代謝癥候群相似。血清總甲狀腺素TT3和TT4是判定甲狀腺功能最基本的指標(biāo)。采血測(cè)甲狀腺激素水平則發(fā)現(xiàn)ClC-3過(guò)表達(dá)組小鼠TT4明顯增高，TT3也有增高的趨勢(shì)，甲狀腺分泌功能明顯增強(qiáng)。這很可能是因?yàn)镃lC-3表達(dá)增多后，促進(jìn)碘離子外排到濾泡腔內(nèi)，促進(jìn)了甲狀腺球蛋白的碘化過(guò)程，從而促進(jìn)了甲狀腺激素的合成；研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組小鼠TSH有下降的趨勢(shì)但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TSH是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺生長(zhǎng)和機(jī)能的激素，一方面受到T3和T4反饋性抑制[13]，另一方面受下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素的促進(jìn)，二者互相拮抗，它們組成下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸。因此，本研究中TSH的變化不明顯，很可能與下丘腦和垂體的功能相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ClC-3過(guò)表達(dá)可引起小鼠甲狀腺組織增生，T3和T4分泌增多；ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠表現(xiàn)類似甲狀腺功能亢進(jìn)的高代謝癥狀。

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