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Notch信號在脂多糖誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用*

2018-03-01 18:26:00王繼榮岳影星代繼桓楊舟鑫
中國病理生理雜志 2018年2期
關(guān)鍵詞:充質(zhì)配體干細(xì)胞

王繼榮, 盧 艷, 岳影星, 代繼桓, 楊舟鑫△

(浙江醫(yī)院 1浙江省老年醫(yī)學(xué)重點實驗室, 2放射科, 浙江 杭州 310013)

從骨髓中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以黏附在塑料培養(yǎng)瓶中快速增殖,并具有向脂肪、骨髓和軟骨細(xì)胞分化的能力,因此可以作為細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞[1]。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能,在多種免疫相關(guān)疾病中被認(rèn)為有良好的應(yīng)用前景。最近研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可通過再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗凋亡等減輕炎癥反應(yīng)[2]。

Notch信號通路在進(jìn)化上高度保守,通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用對造血干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞及T和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能的發(fā)揮都有重要的調(diào)節(jié)作用,并參與腫瘤、病毒感染、炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號能增強Notch途徑的活性,而且更重要的是,Notch1和Notch2活性形式的過量表達(dá),會抑制TLR4開啟的炎癥細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 和白細(xì)胞介素6(intreleukin-6,IL-6)]的生成,并且促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的生成[4]。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以被細(xì)胞表面TLR4識別,繼而引發(fā)多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]。然而,Notch信號是否參與LPS所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)尚不明確。在本研究中,我們探討了Notch信號通路對LPS所誘導(dǎo)的BMSCs增殖和炎癥因子分泌的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基為STEMCELL Technologies產(chǎn)品;PBS和胰酶為吉諾公司產(chǎn)品;脂多糖與DAPT為Sigma產(chǎn)品;RNA提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒為Thermo產(chǎn)品;IL-6的ELISA試劑盒為eBioscience產(chǎn)品;趨化因子CXCL1的ELISA試劑盒為PeproTech產(chǎn)品。酶標(biāo)儀購自Thermo;倒置相差顯微鏡購自Leica;定量PCR儀購自Roche。

2主要方法

2.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 6~8周雄性C57BL/6小鼠購自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,質(zhì)量合格證號為No. 1612060018。頸椎脫臼法處死小鼠后,75%乙醇中浸泡5 min,取出兩側(cè)腿骨,置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中小心剔除粘連于骨上的肌肉組織,剪去腿骨兩端,用1 mL注射器抽取已經(jīng)預(yù)先配好的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,直至骨發(fā)白,收集沖洗液,反復(fù)吹打使細(xì)胞打散,移至滅菌的10 mL離心管中,4 ℃、1 600 r/min離心5 min,棄上清,用小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至5×109/L,接種到T25培養(yǎng)瓶,置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后,輕輕吸出上清,并加入新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液1次,并觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化和傳代擴(kuò)增 原代細(xì)胞生長至大約80%融合時,吸去上清,加入0.125%胰蛋白酶,37 ℃條件下消化至細(xì)胞呈圓形,用完全培養(yǎng)基終止反應(yīng),用PBS沖洗細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到一個15 mL的離心管中, 4 ℃、1 600 r/min離心5 min,棄上清,再加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,按1∶3比例傳代,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),直至細(xì)胞生長至接近80%時,重復(fù)以上操作,再次傳代。取6~10代的間充質(zhì)干細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.3MTT法和活細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖 將BMSCs以每孔2×103的密度種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后分別加入LPS (10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L)與DAPT(10 mg/L),對照(control)組加入等體積DMSO。72 h后加入MTT檢測細(xì)胞活力,并置于培養(yǎng)箱中,3 h后棄溶液,加入100 μL DMSO溶解并在酶標(biāo)儀上檢測490 nm處吸光度(A)。

將BMSCs以每孔3×104的密度種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后分別加入LPS(1 mg/L)與DAPT(10 mg/L),對照組加入等體積DMSO。LPS刺激72 h后,拍照,用胰酶消化后加入2 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,取20 μL細(xì)胞懸液加入80 μL臺盼藍(lán)混勻,最后用微量移液器吸取10 μL進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。

2.4qPCR檢測基因表達(dá) BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS,DAPT組加入10 mg/L的DAPT,LPS刺激24 h后,收集細(xì)胞。使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)抽提細(xì)胞總RNA,用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA,并使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix來進(jìn)行qPCR。使用LightCycler 480實時定量PCR擴(kuò)增儀(Roche)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參照,分析目的基因的相對表達(dá)量。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過繪制熔解曲線來進(jìn)行驗證。用于qPCR的引物見表1。

2.5Western blot法檢測蛋白表達(dá) BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS,LPS刺激的48 h后,收集細(xì)胞。

表1 qPCR引物

F: forward; R: reverse.

Western blot按照標(biāo)準(zhǔn)的流程進(jìn)行,主要包括:蛋白的提取和定量、電泳樣本制備及SDS-PAGE;然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上,將轉(zhuǎn)印后的膜用5% BSA室溫封閉1 h,TBST清洗后加入I抗(Notch1、Notch2、Jagged1、Dll3、Dll4和Hes1抗體購自Cell Signaling Technology;Notch3、Notch4、Jagged2、Dll1和Hey1抗體購自Abcam)4 ℃孵育過夜;TBST清洗后再用熒光II抗室溫孵育1 h;清洗后以O(shè)dyssey顯像系統(tǒng)觀察和拍攝Western blot條帶。

2.6ELISA檢測IL-6與CXCL1的分泌 吸取未加MTT的方法2.3培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)上清,使用ELISA 試劑盒,按照說明書的方法,檢測IL-6或CXCL1濃度。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett’s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1LPS對BMSCs活力和IL-6分泌的影響

分離小鼠原代BMSCs,貼壁培養(yǎng)后觀察,細(xì)胞呈梭形且可以在體外迅速擴(kuò)增,進(jìn)一步經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)CD29與CD106而非CD31與CD45,并且具備成骨與成脂分化能力,說明分離篩選成功,詳見參考文獻(xiàn)[6],本實驗材料與該文獻(xiàn)中所用BMSCs為同一批。添加LPS刺激BMSCs,MTT結(jié)果顯示不同濃度LPS均可以促進(jìn)小鼠BMSCs的增殖,其中100 μg/L與1 mg/L有顯著作用,見圖1A;ELISA結(jié)果顯示10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L LPS均可以促進(jìn)IL-6的分泌,其中1 mg/L的效果最為明顯,見圖1B。因此后續(xù)的實驗均選取LPS濃度為1 mg/L。

2LPS對BMSCs中Notch信號通路相關(guān)蛋白的影響

Notch信號通路在干細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮重要作用,我們檢測了脂多糖對Notch信號通路受體、配體與靶基因表達(dá)的影響。qPCR結(jié)果顯示,BMSCs表達(dá)Notch信號的受體,包括Notch1~Notch4,其中Notch1和Notch3的相對表達(dá)量較高;然而,Notch信號受體的mRNA水平并沒有由于LPS的刺激而發(fā)生明顯變化,見圖2A。BMSCs也可檢測到Notch信號配體的表達(dá),包括Jagged1、 Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4,其中Jagged1的相對表達(dá)量較高;同樣,LPS并不影響Notch信號配體的mRNA水平,見圖2B。同時,我們利用Westerm blot檢測上述Notch信號受體與配體的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,LPS并不影響Notch信號受體與配體的蛋白水平,見圖3A。另外,我們檢測了Notch信號靶基因Hes1與Hey1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS顯著誘導(dǎo)Hes1與Hey1的蛋白表達(dá)(P<0.05),見圖3B。

Figure 1. The effects of LPS on the cell viability (A) and secretion of IL-6 (B) in the BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1脂多糖對BMSCs活力和IL-6分泌的促進(jìn)作用

Figure 2. The mRNA expression levels of Notch receptors (A) and ligands (B) in the BMSCs treated with LPS. Mean±SD.n=4.

圖2Notch信號通路受體與配體的mRNA表達(dá)

Figure 3. The protein levels of Notch receptors, ligands and target genes in the BMSCs treated with LPS. A: Western blot assay of Notch receptors and ligands; B: Western blot assay of target genes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3Notch信號通路受體、配體與靶基因的蛋白水平

3Notch信號對LPS誘導(dǎo)的BMSCs增殖的影響

我們進(jìn)一步利用Notch信號通路抑制劑DAPT處理BMSCs,檢測Notch信號通路對BMSCs活力的影響。MTT法結(jié)果顯示,LPS顯著提高BMSCs活力,而DAPT不僅降低對照組BMSCs活力,更顯著地抑制了LPS所誘導(dǎo)的BMSCs的活力,見圖4A。進(jìn)一步通過活細(xì)胞計數(shù)的方法,我們確定在LPS處理組和不處理組,DAPT均可以降低BMSCs的增殖能力(P<0.05或P<0.01),見圖4B。

Figure 4. The cell viability (A) and numbers (B) of BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖4DAPT對LPS刺激下的細(xì)胞增殖的影響

4Notch信號對LPS誘導(dǎo)的IL-6與CXCL1分泌的影響

為了進(jìn)一步檢測Notch信號對炎癥的影響,利用LPS與Notch信號通路抑制劑DAPT共同刺激BMSCs。結(jié)果顯示,LPS顯著誘導(dǎo)IL-6與CXCL1的分泌,而DAPT可以顯著降低LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6與CXCL1的濃度(P<0.01),說明DAPT對LPS誘導(dǎo)的BMSC細(xì)胞炎癥因子的分泌有抑制作用,見圖5。

Figure 5. The secretion of IL-6 (A) and CXCL1 (B) in the BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsDMSO group.

圖5DAPT對LPS誘導(dǎo)的IL-6與CXCL1分泌的影響

討 論

在脂多糖處理下,小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強,并且細(xì)胞因子如IL-6分泌能力改變。大腸桿菌、盲腸穿孔與急性肺損傷誘導(dǎo)的膿毒癥模型中,給予人MSCs均可以提高小鼠存活率,降低IL-6和TNF-α水平,同時提高抗炎因子IL-10的水平[7-9]。本研究中,我們研究了Notch信號通路抑制劑DAPT對脂多糖誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的作用。DAPT可以抑制LPS誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和IL-6與CXCL1的分泌,這說明Notch信號通路對于LPS誘導(dǎo)的BMSCs性質(zhì)的改變有調(diào)節(jié)作用。

Notch信號通路對正常MSCs的增殖均存在調(diào)節(jié)作用,本研究中通過DAPT抑制Notch信號通路,也可以明顯降低BMSCs的增殖能力。Notch信號通路對于細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)能力已見于多篇文獻(xiàn)中報導(dǎo)[10-11]。盡管LPS處理后間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的明顯上升并不一定與Notch信號通路相關(guān),但通過抑制Notch信號通路可以改變LPS誘導(dǎo)的BMSCs相關(guān)性質(zhì)的改變。這提示Notch信號通路可能是感染誘導(dǎo)干細(xì)胞變化的重要治療靶點。

脂多糖對MSCs的調(diào)節(jié)作用依賴于TLR4,并通過NF-κB信號通路和Wnt信號通路促進(jìn)MSC的增殖和成骨分化[12]。本研究也進(jìn)一步證實了LPS對BMSCs增殖和IL-6的促進(jìn)作用,在此基礎(chǔ)上,本研究表明,Notch信號通路也可以參與LPS誘導(dǎo)的BMSC的增殖能力和IL-6與CXCL1分泌的變化。Li等[13]發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血小鼠模型中MSCs通過Notch/RBP-J/FOXP3/ROR信號調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡。Notch信號通路可以上調(diào)NF-κB的活性[14];Notch信號通路和Wnt信號也有協(xié)同作用[10, 15]。因此,Notch信號通路可能是通過與NF-κB和Wnt信號通路相互作用,共同調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)。

總之,Notch信號通路抑制劑DAPT可以抑制LPS誘導(dǎo)的BMSCs增殖及IL-6和CXCL1的分泌。本項研究的結(jié)果為研究膿毒癥等疾病中間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)的變化提供了更多的信息,為間充質(zhì)干細(xì)胞在這些疾病中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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