郭翔宇，陳書(shū)強(qiáng)，李博

(空軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

臨床上，為了提高輔助生殖的成功率及避免多胎妊娠，很多時(shí)候會(huì)選擇單囊胚進(jìn)行胚胎移植[1-3]。目前已經(jīng)有研究表明單囊胚移植在不降低妊娠率的同時(shí)能夠顯著降低多胎妊娠率[4]。因此，臨床上一直在努力建立篩選健康胚胎的新方法。另外，無(wú)論在臨床上還是在動(dòng)物模型上所觀察到的輔助生殖技術(shù)(ART)對(duì)植入后胎盤(pán)、胎兒以及出生后個(gè)體的影響，都是ART對(duì)早期胚胎影響的延續(xù)。因此，評(píng)估體外受精對(duì)囊胚期胚胎的影響，是非常必要的。

資料和方法

一、動(dòng)物來(lái)源

小鼠品系為ICR清潔級(jí)小鼠，購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡。

二、主要儀器和試劑

孕馬血清促性腺釋放激素(PMSG)、HCG(Prospec Protein Specialists，以色列)、KSOM(Millipore，美國(guó))、戊巴比妥鈉(Sigma，德國(guó))、多聚甲醛(Sigma，德國(guó))、RNeasy Plus Micro Kit(Qiagen，德國(guó))、Quanti TectReverse Transcription Kit(Qiagen，德國(guó))、SYBR(Sigma，德國(guó))。

實(shí)體解剖鏡(Motic，中國(guó))，電子天平AA-160(Denver Instrument Company，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))、培養(yǎng)皿(35 mm)/四孔板(Nunc，丹麥)、超凈臺(tái)(Labconco，美國(guó))、熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))。

三、研究方法

1.獲取囊胚:以下胚胎操作實(shí)驗(yàn)方法均來(lái)自《Manipulating the Mouse Embryo-A Laboratory Manual，3rdedition》[5]。

(1)獲取自然交配形成的囊胚(in vivo組)：取24 g左右的雌性小鼠，腹腔注射7.5 U PMSG，46～48 h后腹腔注射7.5 U HCG；與雄鼠合籠，次日檢查陰栓。在見(jiàn)栓后72 h，將雌鼠處死，剪取雙側(cè)子宮和部分輸卵管，將吸有mHTF培養(yǎng)液(自制)的針頭插入子宮角，將囊胚沖出，收集囊胚，在mHTF培養(yǎng)液中洗滌，待用。

(2)體內(nèi)受精-體外培養(yǎng)獲取的囊胚(IVC組)：超排卵及交配處理同前。次日檢查陰栓，在注射HCG 20 h 后，處死雌鼠，取MⅡ卵獲取受精卵團(tuán)，用0.3%透明質(zhì)酸酶消化卵團(tuán)，然后用吸管將消化分離的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入4～5 滴100 μl的mHTF培養(yǎng)液，以洗去透明質(zhì)酸酶和顆粒細(xì)胞，待繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。

(3)體外受精獲取囊胚(IVF組)：①獲取MII卵：雌鼠促排卵處理同前。注射HCG 14～16 h 后斷頸處死小鼠，剪取輸卵管，置于平皿中，在100 μl 的mHTF培養(yǎng)液中清洗1次，轉(zhuǎn)入另一100 μl的mHTF培養(yǎng)液滴，用尖頭鑷子撕開(kāi)輸卵管呈半透明狀的膨大部位，輕壓撕開(kāi)處，令卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的復(fù)合體流出，用鑷子將流出的復(fù)合體轉(zhuǎn)入4～5 滴100 μl的mHTF培養(yǎng)液中洗滌，待用。②精子的準(zhǔn)備與獲能：取5日內(nèi)未交配過(guò)的3～6月齡雄性小鼠，斷頸處死后剪取雙側(cè)附睪尾，置入300 μl 37℃、5%CO2條件下預(yù)平衡4 h以上的HTF培養(yǎng)液中，剪開(kāi)數(shù)段，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20 min使精子自行游出后取出附睪尾，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h使精子獲能。③卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備與體外受精：MII卵丘團(tuán)置于500 μl 預(yù)平衡過(guò)的HTF培養(yǎng)液中，加入30 μl獲能精子上層懸液，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h以使卵母細(xì)胞受精。④體外培養(yǎng)：將含有兩個(gè)原核的受精卵以每20 μl 10個(gè)受精卵的密度培養(yǎng)于石蠟油覆蓋的KSOM溶液中。分別在24、48、84 h后檢查胚胎發(fā)育至2-cell、4-cell和囊胚的比率。

2.胚胎移植：取6周齡以上雌鼠，與結(jié)扎雄鼠合籠過(guò)夜，次日晨檢查陰栓，見(jiàn)陰栓當(dāng)日記作假孕0.5 d(D 0.5)，作為假孕鼠備用。取3.5 d(D 3.5)假孕鼠，按0.01 ml/g體重進(jìn)行腹腔注射1%(w/v)濃度的戊巴比妥鈉麻醉劑，待小鼠麻醉后，背側(cè)正中開(kāi)一小口，鈍性分離皮膚和皮下組織層，于子宮角對(duì)應(yīng)肌肉層開(kāi)一小口，拉出脂肪墊固定，用1 ml注射針頭于子宮角無(wú)血管處順子宮方向扎一小口后，同位置插入口吸管，將囊胚(每側(cè)8 枚)輕吹入子宮腔，取出口吸管后還納子宮卵巢，縫合傷口。

3.囊胚的細(xì)胞計(jì)數(shù)：免疫殺傷法計(jì)算總細(xì)胞數(shù)及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)的比值。

選取不同組別形態(tài)相似的擴(kuò)張期囊胚(Grade II)，用酸性臺(tái)氏液將囊胚透明帶去除，之后用含0.1% PVA的PBS(PBSA)緩沖液清洗3遍；將囊胚轉(zhuǎn)移到含10 mmol/L TNBS(Baomanbio，中國(guó))的PBSA中，冰上放置10 min；之后，將囊胚轉(zhuǎn)移到含30%的anti-DNP-BSA(Thermo，美國(guó))的PBSA中，37℃放置30 min；將囊胚轉(zhuǎn)移至含20%的豚鼠補(bǔ)體(Sigma，美國(guó))及10 μg/ml PI(Sigma，美國(guó))的PBSA中，37℃放置20 min；用4%多聚甲醛固定胚胎，同時(shí)加入10 μg/ml的Hoechst 33258(MCE，美國(guó))進(jìn)行染色，4℃放置2 h；囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上進(jìn)行封片，然后在熒光顯微鏡下觀察。

分別在380 nm和460 nm(或535 nm)激發(fā)波長(zhǎng)下觀察拍照，前者觀察到的為總細(xì)胞，后者為T(mén)E(滋養(yǎng)層)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞總數(shù)減去TE細(xì)胞數(shù)即為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞數(shù)，由此可計(jì)算出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)比值。

4.胚胎植入和活產(chǎn)的判定：胚胎移植后第11天，即孕14.5 d，斷頸處死代孕母鼠后剪取雙側(cè)子宮，浸泡在4℃預(yù)冷的PBS緩沖液中，用解剖鑷鈍性剝離胎兒胎盤(pán)，去除羊膜及其他胚外組織，以PBS緩沖液清洗。

活產(chǎn)包括形態(tài)學(xué)正常的胚胎；植入包括：①活產(chǎn)；②肉眼可見(jiàn)的已經(jīng)機(jī)化的黑色植入點(diǎn)。

5.囊胚qRT-PCR：(1)囊胚mRNA抽提：每200個(gè)囊胚為一組，以PBS清洗3遍后置于RNAse-free的EP管中，盡量吸走多余的PBS，采用RNeasy? Plus Micro Kit(Qiagen，德國(guó))抽提總RNA，具體步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。(2)cDNA合成：以囊胚總RNA為材料，采用QuantiTect? Reverse Transcription Kit(Qiagen，德國(guó))合成總cDNA，具體步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。(3)囊胚期細(xì)胞命運(yùn)決定因子檢測(cè)：采用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)配套軟件進(jìn)行反應(yīng)模塊排版，基于SYBR? Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，以H2afz為內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量，檢測(cè)囊胚期細(xì)胞命運(yùn)決定因子的表達(dá)。引物序列查詢自Primerbank，詳見(jiàn)表1。(4)實(shí)時(shí)定量PCR：采用Sigma公司SYBR? Green JumpStartTMTaqReadyMixTMq-PCR反應(yīng)液。反應(yīng)總體系25 μl：SYBR 12.5 μl、Primer pair 1 μl、cDNA 1.5 μl、ddH2O 10 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min，65℃～95℃(每15 s升高0.5℃)。以上在每個(gè)PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得熔解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。

表1 目的基因引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用單因素-ANOVA進(jìn)行分析，胚胎植入率等計(jì)數(shù)型對(duì)比資料采用χ2進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、體外受精對(duì)囊胚細(xì)胞總數(shù)、TE和ICM細(xì)胞數(shù)目的影響

囊胚期細(xì)胞總數(shù)以及TE/ICM比值和胚胎質(zhì)量相關(guān)[6]。因此我們對(duì)in vivo、IVC和IVF三組不同來(lái)源的囊胚進(jìn)行了細(xì)胞差別染色，以便識(shí)別TE和ICM細(xì)胞(圖1)。

為了避免胚胎級(jí)別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們所有的實(shí)驗(yàn)均選擇二級(jí)囊胚即擴(kuò)張期囊胚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)：in vivo組(n=23)、IVC組(n=24)、IVF組(n=26)囊胚細(xì)胞總數(shù)分別為(75.05±6.76)、(58.21±3.66)、(58.96±3.75)，TE細(xì)胞總數(shù)分別為(54.5±5.59)、(40.95±4.29)、(42.88±3.67)，ICM細(xì)胞總數(shù)分別為(28.29±5.11)、(17.35±2.96)、(16.04±2.72)；與in vivo組相比，IVF組和IVC組囊胚細(xì)胞總數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)、ICM細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.01)(圖1)。in vivo組、IVC組、IVF組TE/ICM比值分別為(0.38±0.08)、(0.43±0.11)、(0.38±0.09)，三組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

二、體外受精對(duì)囊胚期細(xì)胞命運(yùn)決定因子表達(dá)的影響

我們進(jìn)一步對(duì)in vivo、IVC和IVF三組不同來(lái)源的囊胚進(jìn)行了細(xì)胞譜系決定重要因子表達(dá)的相對(duì)定量，結(jié)果顯示：IVC和IVF來(lái)源的囊胚多潛能因子Nanog、Sox2表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，但是維持滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，TE)存活、調(diào)控原始外胚層(Primitive endoderm，PE)分化的、由上胚層(Epiblast)分泌的因子Fgf4的表達(dá)水平卻顯著下調(diào)(P<0.05)；IVF和IVC導(dǎo)致PE分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Gata4、Sox17的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；IVF和IVC導(dǎo)致TE分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Eomes和Elf5的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；IVF和IVC還導(dǎo)致調(diào)控重要信號(hào)通路的內(nèi)分泌因子Lif的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

A：囊胚的細(xì)胞差別染色(藍(lán)色代表ICM，紅色代表TE)；B：三組總細(xì)胞數(shù)比較；C：三組TE細(xì)胞數(shù)比較；D：三組ICM細(xì)胞數(shù)比較。與in vivo組相比，IVC和IVF組的總細(xì)胞數(shù)、ICM、TE細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.01)，IVC組與IVF組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)圖1 體外受精對(duì)囊胚細(xì)胞總數(shù)、TE和ICM細(xì)胞數(shù)量的影響

與In vivo組相比，*P<0.05圖2 體外受精對(duì)囊胚期細(xì)胞命運(yùn)決定因子表達(dá)的影響

三、體外受精對(duì)胚胎植入率及成活率的影響

胚胎植入率以及植入后成活率是評(píng)估胚胎質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。我們選擇in vivo、IVC、IVF來(lái)源的擴(kuò)張期囊胚，進(jìn)行了胚胎移植實(shí)驗(yàn)，在孕14.5 d時(shí)比較胚胎植入率以及植入后胚胎成活率。結(jié)果顯示：in vivo組 (n=96)、IVC組(n=95)和IVF組(n=93)的胚胎植入率分別為(74.00±4.34)%、(73.67±2.08)%和(71.96±5.17)%，這表明體外受精和體外培養(yǎng)均不影響胚胎的植入率(P>0.05)。但我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，體外受精來(lái)源的胚胎植入后胚胎的成活率顯著低于in vivo組和IVC組(P<0.05)，表明體外受精會(huì)影響胚胎植入之后的進(jìn)一步發(fā)育，導(dǎo)致胚胎成活率降低(表2)。

表2 比較三組囊胚植入率、成活率、活產(chǎn)率與流產(chǎn)率 (-±s)

注：與In vivo組和IVC組相比，*P<0.05

討 論

近年來(lái)，ART囊胚移植率逐漸升高，其優(yōu)勢(shì)在于囊胚移植能夠與子宮內(nèi)膜發(fā)育程度相符，減少了促排卵過(guò)程中大量使用激素對(duì)子宮內(nèi)膜的影響，使胚胎更易于著床；同時(shí)，整個(gè)囊胚培養(yǎng)過(guò)程是對(duì)胚胎的一個(gè)篩選過(guò)程，能夠淘汰大部分非整倍體以及具有遺傳缺陷的胚胎[7]。無(wú)論是在臨床上還是動(dòng)物模型上觀察到的輔助生殖技術(shù)對(duì)植入后胎盤(pán)、胎兒、及出生后個(gè)體的影響，都是輔助生殖技術(shù)對(duì)早期胚胎操作影響的延續(xù)。因此，為了更好地改善ART的臨床結(jié)局，對(duì)體外受精過(guò)程中囊胚發(fā)生的改變進(jìn)行評(píng)估是非常必要的。

囊胚由ICM和TE組成，TE細(xì)胞主要功能是胚胎與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，以支持ICM的發(fā)育分化。ICM/TE以及總細(xì)胞數(shù)常用于評(píng)估囊胚質(zhì)量[8]。臨床上用于移植的胚胎均為優(yōu)質(zhì)囊胚，因此我們?yōu)榱烁N近臨床實(shí)際，選取了擴(kuò)張期二級(jí)囊胚作為研究對(duì)象。盡管不同組別胚胎發(fā)育速度會(huì)有所差異，會(huì)導(dǎo)致同一時(shí)期的胚胎細(xì)胞數(shù)有所不同，但是同一級(jí)別的囊胚形態(tài)相同，三組之間囊胚細(xì)胞數(shù)是有可比性的。我們發(fā)現(xiàn)，即使是同樣形態(tài)的擴(kuò)張期囊胚，體外受精來(lái)源的囊胚以及體內(nèi)受精-體外發(fā)育的囊胚相對(duì)于體內(nèi)發(fā)育的囊胚在細(xì)胞總數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)以及ICM細(xì)胞數(shù)方面均顯著減少。有研究表明，體外培養(yǎng)會(huì)影響植入前胚胎發(fā)育率，具體表現(xiàn)為ICM細(xì)胞數(shù)以及ICM/TE比值的降低[9]，而暴露在不良環(huán)境中也會(huì)使ICM細(xì)胞數(shù)和ICM/TE比值顯著下降[10]。這與本研究結(jié)果基本相符。雖然本實(shí)驗(yàn)中ICM/TE比值無(wú)顯著差異，原因可能是ICM與TE細(xì)胞數(shù)量均減少，導(dǎo)致比值無(wú)顯著改變；但是考慮到三組同級(jí)別的囊胚比較，IVF組細(xì)胞總數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)，ICM細(xì)胞數(shù)均顯著減少，綜合評(píng)估體外受精的胚胎質(zhì)量低于體內(nèi)發(fā)育的囊胚。

有研究表明，囊胚的形態(tài)和發(fā)育率與胚胎整倍性相關(guān)[17]，所有整倍體胚胎植入率相似，與囊胚的形態(tài)和發(fā)育率無(wú)關(guān)。我們檢測(cè)了體外受精對(duì)胚胎植入率及植入后胚胎存活率的影響，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)組和體內(nèi)自然發(fā)育組相比雖然植入率等有所降低，但是并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而體外受精雖不影響胚胎的植入率，但植入后胚胎的存活率顯著降低。提示與體外培養(yǎng)相比，體外受精這一操作更容易影響胚胎質(zhì)量，是導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降、不良妊娠結(jié)局的主要原因。

目前有報(bào)道表明，H19的ICR區(qū)域甲基化水平的降低和臨床上自發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)，并且在動(dòng)物模型上也得到了驗(yàn)證[18-21]。我們觀察到體外受精的小鼠胚胎植入后存活率的降低可能和體外受精導(dǎo)致的印記基因ICR區(qū)域印記丟失相關(guān)。進(jìn)一步澄清體外受精導(dǎo)致小鼠胚胎植入后存活率降低的原因，將有助于確定表觀遺傳紊亂與胚胎質(zhì)量的關(guān)系，為臨床上完善輔助生殖技術(shù)提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF會(huì)導(dǎo)致小鼠囊胚胚胎質(zhì)量和移植后成活率下降，初步揭示了囊胚質(zhì)量的相關(guān)分子水平的改變。后期還需實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究IVF胚胎的表觀遺傳學(xué)是否發(fā)生改變，以及導(dǎo)致囊胚質(zhì)量下降的分子機(jī)制，才能進(jìn)一步為臨床上改善ART結(jié)局和預(yù)防ART嬰兒出生后遠(yuǎn)期安全性問(wèn)題提供理論依據(jù)。

[1] Stillman RJ，Richter KS，Banks NK，et al.Elective single embryo transfer：a 6-year progressive implementation of 784 single blastocyst transfers and the influence of payment method on patient choice[J].Fertil Steril，2009，92：1895-1906.

[2] Adashi EY，Gleicher N.Is a blanket elective single embryo transfer policy defensible?[J].Rambam Maimonides Med J，2017，8.

[3] Wang X，Du M，Guan Y，et al.Comparative neonatal outcomes in singleton births from blastocyst transfers or cleavage-stage embryo transfers：a systematic review and meta-analysis[J].Reprod Biol Endocrinol，2017，15：36.

[4] 薛俠，施文浩，師娟子，等.D5選擇性的單囊胚移植和雙囊胚胎移植妊娠結(jié)局比較[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23：276-279.

[5] Richard B，Marina G，Kristina VN，et al.Manipulating the mouse embryo[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2014：1-795.

[6] Lane M，Gardner DK.Nonessential amino acids and glutamine decrease the time of the first three cleavage divisions and increase compaction of mouse zygotes in vitro[J].J Assist Reprod Genet，1997，14：398-403.

[7] Cardellicchio L，Reschini M，Paffoni A，et al.Frozen-thawed blastocyst transfer in natural cycle：feasibility in everyday clinical practice[J].Arch Gynecol Obstet，2017，295：1509-1514.

[8] Qu P，Qing S，Liu R，et al.Effects of embryo-derived exosomes on the development of bovine cloned embryos[J/OL].PLoS One，2017，12：e174535.

[9] 王保壘，趙禹，劉軍，等.共培養(yǎng)對(duì)小鼠囊胚質(zhì)量及其表觀遺傳修飾的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009，25：733-738.

[10] Maluf M，Perin PM，F(xiàn)oltran Januário DA，et al.In vitro fertilization，embryo development，and cell lineage segregation after pre-and/or postnatal exposure of female mice to ambient fine particulate matter[J].Fertil Steril，2009，92：1725-1735.

[11] Whitmill A，Liu Y，Timani KA，et al.Tip110 deletion impaired embryonic and stem cell development involving downregulation of stem cell factors Nanog，Oct4，and Sox2[J].Stem Cells，2017，35：1674-1686.

[12] Guo G，Huss M，Tong GQ，et al.Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst[J].Dev Cell，2010，18：675-685.

[13] Soma M，Iha M，Kihara Y，et al.Preferential emergence of cell types expressing markers for primitive endoderm lineages in mouse embryonic stem cells expressing exogenous EGAM1 homeoprotein[J].J Biosci Bioeng，2012，114：342-346.

[14] HosseinNia P，Hajian M，Tahmoorespur M，et al.Expression profile of developmentally important genes in pre and peri-implantation goat embryos produced in vitro[J].Int J Fertil Steril，2016，10：310-319.

[15] Veraguas D，Gallegos PF，Velasquez AE，et al.FSH stimulation of anestrous cats improves oocyte quality and development of parthenogenetic embryos[J].Theriogenology，2017，87：25-35.

[16] Rodríguez-Alvarez L，Cox J，Tovar H，et al.Changes in the expression of pluripotency-associated genes during preimplantation and peri-implantation stages in bovine cloned and in vitro produced embryos[J].Zygote，2010，18：269-279.

[17] Majumdar G，Majumdar A，Verma IC，et al.Relationship between morphology，euploidy and implantation potential of cleavage and blastocyst stage embryos[J].J Hum Reprod Sci，2017，10：49-57.

[18] Pathak S，Kedia-Mokashi N，Saxena M，et al.Effect of tamoxifen treatment on global and insulin-like growth factor 2-H19 locus-specific DNA methylation in rat spermatozoa and its association with embryo loss[J].Fertil Steril，2009，91：2253-2263.

[19] Ankolkar M，Patil A，Warke H，et al.Methylation analysis of idiopathic recurrent spontaneous miscarriage cases reveals aberrant imprinting at H19 ICR in normozoospermic individuals[J].Fertil Steril，2012，98：1186-1192.

[20] Liu Y，Tang Y，Ye D，et al.Impact of abnormal DNA methylation of imprinted loci on human spontaneous abortion[J].Reprod Sci，2017，1：1933719117704906.

[21] Carrell DT.Aberrant methylation of the H19 imprinting control region may increase the risk of spontaneous abortion[J].Epigenomics，2013，5：23-24.