李靖靖，李紅梅

（鄒平縣綜合檢驗檢測中心，山東鄒平 256200）

隨著臨床上抗生素的普遍應(yīng)用，很多感染性病菌的耐藥性也逐漸增強，致使抗生素的劑量不斷加大，如耐青霉素的肺炎球菌、耐萬古霉素的腸球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌等[1-2]。因此迫切需要新型抗生素來抵抗這些耐藥菌株的感染，而普那霉素則成了新型抗生素的首選。普那霉素屬于鏈陽性菌素類抗生素，由始旋鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，可以通過與核糖體結(jié)合從而抑制蛋白的合成，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有強烈的抑制作用，是萬古霉素的替代藥物[3]。更重要的是，對普那霉素制劑的臨床應(yīng)用證明，只有極少數(shù)的細菌會對其產(chǎn)生微弱的耐藥性，因此普那霉素在抵抗多重耐藥菌方面起到了重要作用，具有廣闊市場前景[4]。

目前，國內(nèi)對普那霉素的研究較少，菌株發(fā)酵產(chǎn)量尚處于較低的水平，一般效價不超過2 000 μ/mL，發(fā)酵單位不超過1 500 mg/L[3-4]。為了進一步提升普那霉素的發(fā)酵水平、降低生產(chǎn)成本，試驗對一株普那霉素產(chǎn)生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15進行了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，并且取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

放線菌S.pristinaespiralis LS15，土壤中篩選并由實驗室保藏。

瓊脂培養(yǎng)基：淀粉15 g/L，黃豆粕3 g/L，可溶性酵母粉1 g/L，瓊脂18 g/L，初始pH值7.0。于121℃條件下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：可溶性酵母粉6 g/L，葡萄糖30 g/L，KH2PO4·2H2O 1.2 g/L，（NH4）2SO45 g/L，K2HPO4·2H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O 0.03 g/L，pH 值 7.0。于115℃條件下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)：從瓊脂培養(yǎng)基上刮取孢子兩環(huán)，在無菌條件下接入50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取種子液4 mL，無菌條件下接入50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。

1.3 PB-CCD優(yōu)化培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基中有8種成分，其中FeSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O這2種成分屬于微量元素，添加量較小，因而暫時不作為優(yōu)化的對象，其余6種培養(yǎng)基組分的添加量較大，在此作為重點優(yōu)化對象。PB-CCD的設(shè)計及結(jié)果分析采用軟件Design-Expert 8.0。

1.4 發(fā)酵液中普那霉素含量測定

高效液相色譜法測定發(fā)酵液中普那霉素含量[3]。

1.5 酶活測定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）、天冬氨酸激酶 （Aspartokinase，AK）、檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS） 的酶活測定參照相關(guān)文獻[5-8]。

2 結(jié)果與分析

S.pristinaespiralis LS15目前發(fā)酵培養(yǎng)基的組成有8種物質(zhì)，如前所述，鋅和鐵2種金屬離子對于微生物的生理代謝及酶的催化具有重要作用，嚴格來講不屬于營養(yǎng)成分，而且其濃度在一定范圍內(nèi)對普那霉素的產(chǎn)量影響不大，所以暫時沒有對其進行優(yōu)化。試驗采用PB-CCD的響應(yīng)面方法對菌株S.pristinaespiralis LS15發(fā)酵培養(yǎng)基的6種主要營養(yǎng)成分進行了優(yōu)化研究，并取得了較好的效果。

2.1 PB試驗篩選主要因素

Plackett-Burman（PB） 試驗是一種近飽和二水平試驗設(shè)計方法，能夠在眾多因素中快速地評選出哪些因素對于目標具有顯著的影響[9-10]。采用Design-Expert 7.0軟件，分別對培養(yǎng)基中的優(yōu)化成分選擇了較高水平（以+1表示） 和較低水平（以-1表示）。

PB試驗的分組設(shè)計見表1。

表1 PB試驗的分組設(shè)計

PB試驗根據(jù)所設(shè)計的高低水平可以自動生成一組試驗方案，共12組。按照該方案配制發(fā)酵培養(yǎng)基對S.pristinaespiralis LS15進行不同組別的發(fā)酵試驗，每組3個平行，發(fā)酵結(jié)束后測定普那霉素產(chǎn)量并利用Design-Expert 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。如表2所示，p值是表征模型及因素顯著與否的重要參數(shù)，如果p＜0.05，那就表明該因素具有顯著影響。從表3中看出，首先該模型的p=0.018 4，說明該PB試驗的設(shè)計是合理的，效果非常顯著。p＜0.05的因素有3個，分別是K2HPO4、酵母抽提物和MgSO4，說明這3種成分影響普那霉素搖瓶產(chǎn)量程度較大，而葡萄糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀這3種成分影響較小。表2中的系數(shù)代表了該因素的增量與普那霉素產(chǎn)量的關(guān)系，例如，酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4這3個因素的系數(shù)為正值，表示增加三者的濃度可以進一步提高普那霉素的產(chǎn)量，而增加其他3個因素的濃度會降低普那霉素的合成。但是，由于葡萄糖等3種成分的p＞0.05，影響不顯著，所以在后續(xù)的試驗設(shè)計中，只考慮酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4三者即可。

PB模型的顯著性分析見表2。

表2 PB模型的顯著性分析

2.2 梯度爬坡試驗

根據(jù)表2中的系數(shù)和p值分析，對于普那霉素產(chǎn)量影響較小的3個因素不再做進一步優(yōu)化，其濃度仍然為葡萄糖 50 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2SO45 g/L，而對影響顯著的酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4這3種營養(yǎng)物質(zhì)做后續(xù)的爬坡試驗，以合適的步長最快地逼近最高適響應(yīng)區(qū)域。從表4顯示的結(jié)果可以看出，隨著正系數(shù)影響因素質(zhì)量濃度的增加，普那霉素的產(chǎn)量也隨之增加，與PB試驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測相吻合，在第4組試驗中達到最高值為1.92 g/L。該組別的營養(yǎng)成分質(zhì)量濃度不一定就是最優(yōu)值，但可以肯定普那霉素的產(chǎn)量最高點就在組別4附近，因為各種營養(yǎng)成分間還存在著交互作用，因此將第4組中的可溶性酵母粉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂作為后續(xù)試驗的中心點。

梯度爬坡試驗見表3。

表3 梯度爬坡試驗/g·L-1

2.3 中心組合試驗

在中心組合試驗中，將酵母抽提物質(zhì)量濃度設(shè)定為7～9 g/L，K2HPO4質(zhì)量濃度設(shè)定2～3 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度設(shè)定1～2 g/L，Design-Expert 7.0軟件會自動生成 5 個水平 （-1.682，-1.000，0，1.000，1.682）的試驗考查。

中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

從表4可以看出，該模型的p＜0.000 1，失擬合度不顯著，表明模型可信度較高。而且，根據(jù)普那霉素的實際搖瓶產(chǎn)量與模型預(yù)測值相比較，兩者數(shù)據(jù)差別不大，說明該模型的準確度較高。

Design-Expert軟件同時可以生成3種因素的響應(yīng)面圖及其等高線圖，該圖能夠反映出各種組分的相互影響[11-12]。

酵母抽提物和磷酸氫二鉀對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響見圖1，酵母抽提物和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響見圖2，磷酸氫二鉀和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響見圖3。

從圖1、圖2、圖3可以看出，營養(yǎng)成分間存在兩兩的交互作用，任何一種成分的過高或者過低都會使普那霉素的產(chǎn)量下降。

圖1 酵母抽提物和磷酸氫二鉀對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響

圖2 酵母抽提物和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響

Design-Expert 8.0軟件擬合得到了普那霉素搖瓶產(chǎn)量的二次多項式方程為：

其中b，e，f分別為酵母抽提物、磷酸氫二鉀和硫酸鎂的質(zhì)量濃度。對該回歸方程的3個自變量求導(dǎo)即可得到模型的極值點，軟件的數(shù)據(jù)分析顯示，當酵母抽提物質(zhì)量濃度7.52 g/L，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度2.26 g/L，硫酸鎂質(zhì)量濃度1.81 g/L時，普那霉素產(chǎn)量最高為2.25 g/L。

圖3 磷酸氫二鉀和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產(chǎn)量的影響

根據(jù)PB-CCD的培養(yǎng)基優(yōu)化試驗，得到的優(yōu)化培養(yǎng)基為：酵母抽提物7.5 g/L，葡萄糖50 g/L，KH2PO·42H2O 1.2 g/L，（NH）42SO48 g/L，K2HPO·42H2O 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO·47H2O 0.05 g/L。以上述配比進行普那霉素的搖瓶發(fā)酵，實際質(zhì)量濃度分別為2.33，2.25，2.28 g/L，基本符合模型的預(yù)測值，比起初始培養(yǎng)基的1.18 g/L提高了86.4%，證明了PB-CCD培養(yǎng)基優(yōu)化方法的有效性。

2.4 不同培養(yǎng)基中的胞內(nèi)酶活測定

為了初步說明S.pristinaespiralis LS15在優(yōu)化培養(yǎng)基中能夠高產(chǎn)普那霉素，試驗選取了菌株代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶進行了酶活測定，這些酶包括糖酵解途徑（EMP途徑） 中的己糖激酶（hexokinase，HK） 和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK），二氨基庚二酸途徑（DAP途徑） 中的天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）和三羧酸循環(huán)過程中（TCA） 的檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）。S.pristinaespiralis LS15 分別在初始培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵，相同時間相同處理方式下測定4種酶的活力。

菌株S.pristinaespiralis LS15在2種培養(yǎng)基中的酶活比較見表5。

普那霉素的分子骨架由很多氨基酸殘基聚合而成[2]，因此菌體細胞中氨基酸的合成對于普那霉素的產(chǎn)量有重要的影響，而氨基酸的合成主要來自TCA循環(huán)。從表5的酶活比較中可以看出，CS作為TCA循環(huán)中的第1個關(guān)鍵酶，其酶活在優(yōu)化培養(yǎng)基中提高了68.7%，說明TCA循環(huán)在優(yōu)化培養(yǎng)基中得到了強化。賴氨酸主要由DAP途徑合成，而DAP途徑中的關(guān)鍵酶AK在優(yōu)化培養(yǎng)基中的活性提高了近1倍。TCA循環(huán)的增強勢必需要上游EMP途徑的增強，通過酶活比較可知，EMP途徑中的HK與PK也確實有不同程度的酶活提升。

表5 菌株S.pristinaespiralis LS15在2種培養(yǎng)基中的酶活比較

3 結(jié)論

發(fā)酵是一個非常復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，影響其好壞有諸多因素，其中營養(yǎng)成分是一個非常重要的因素，是進行發(fā)酵調(diào)控及過程優(yōu)化的基礎(chǔ)，并且需要針對不同的普那霉素生產(chǎn)菌或者突變株開發(fā)出適合其生長及合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基。國內(nèi)學(xué)者對普那霉素的研究較少，何云飛等人[13]對一株普那霉素產(chǎn)生菌S.pristinaespiralis 9-10的培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，適合其發(fā)酵的碳源為葡萄糖或淀粉，有機氮源為魚粉，且二者濃度對普那霉素產(chǎn)量均有較大影響；對S.pristinaespiralis ZP-7[14]的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.5 g/L的正丙醇有利于提升普那霉素的發(fā)酵產(chǎn)量；錢思宇等人[15]以S.pristinaespiralis RP59500為研究對象，發(fā)現(xiàn)最適碳源和氮源分別為蔗糖、酵母粉，且補加氨基酸可以有效提升普那霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。試驗確定對S.pristinaespiralis LS15發(fā)酵具有顯著影響作用的因素為酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4，最終搖瓶產(chǎn)量為2.23 g/L，該發(fā)酵水平仍然不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，后續(xù)研究工作需要聚焦于發(fā)酵工藝方面進行優(yōu)化及調(diào)控，進一步提升普那霉素的發(fā)酵水平。

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