徐 云，王婷婷，肖俊美，王寶成 ，徐 建*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130103；2. 通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134000）

益腎補(bǔ)骨液由骨碎補(bǔ)、何首烏、茯苓、續(xù)斷、白芍、當(dāng)歸等12味中藥制成。具有滋補(bǔ)肝腎，強(qiáng)壯筋骨功效。用于肝腎不足，勞傷腰痛，筋骨損傷?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第10冊(cè)，僅有何首烏理化鑒別，何首烏、白芍薄層鑒別，無法全面表征該中藥制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)和化學(xué)成分群的整體性和復(fù)雜性，難以全面的控制益腎補(bǔ)骨液的內(nèi)在質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)研究建立了益腎補(bǔ)骨液HPLC特征圖譜，對(duì)10批益腎補(bǔ)骨液進(jìn)行了指紋圖譜分析。益腎補(bǔ)骨液與組方藥味間有較好的相關(guān)性，采用該法可幫助確定色譜峰的歸屬，進(jìn)一步分析益腎補(bǔ)骨液的化學(xué)組成及來源，為益腎補(bǔ)骨液的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)[1-5]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀；戴安（雙三元）高效液相色譜儀；AB204-E型分析天平。1.2 試藥 甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸等其他試劑均為分析純；益腎補(bǔ)骨液（批號(hào)：160901、160902、160903、160904、160905、160906、160907、160908、160909、160910）均由通藥制藥股份有限公司提供；沒食子酸（批號(hào)：110831-200302 ）、 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：110844-201512 ）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201438）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201111 ）、綠原酸 （批號(hào)：110753-201314 ）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6-9]色譜柱：ACE C18色譜柱，（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.02%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～ 40 min，5%A → 40%A，40～ 50 min，40%A → 40%A，50～ 51 min，40%A → 5%A，51～60 min，5%A→5%A；）流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 取沒食子酸、芍藥苷、綠原酸、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL分別含0.1 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品，精密量取15 mL，加水至30 mL。用乙醚振搖提取2次，30 mL/次，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，30 mL/次，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和水洗2次，20 mL/次，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?0 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算結(jié)果RSD值均小于2.0%。結(jié)果表明，該儀器測(cè)試精度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：160901）益腎補(bǔ)骨液6份，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算結(jié)果RSD值均小于2.0%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份益腎補(bǔ)骨液的供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算結(jié)果RSD值均小于2.0%。結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜建立及相關(guān)性分析 取10批益腎補(bǔ)骨液成品，按上述選定的供試品溶液制備方法和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。將10批益腎補(bǔ)骨液成品的測(cè)試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件，采用中位數(shù)法，多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，共標(biāo)定13個(gè)共有峰，并鑒定歸屬了5個(gè)特征峰；對(duì)13個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬：1號(hào)（沒食子酸）、6號(hào)、8號(hào)（芍藥苷）特征峰歸屬為白芍藥材；2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)（綠原酸）、5號(hào)、7號(hào)、10號(hào)特征峰歸屬為續(xù)斷藥材；9號(hào)（二苯乙烯苷）特征峰歸屬為何首烏藥材；11號(hào)和13號(hào)（柚皮苷）特征峰歸屬為骨碎補(bǔ)藥材。10批成品特征圖譜疊加圖、生成的對(duì)照?qǐng)D譜分別見圖1～圖2。

圖1 10批成品特征圖譜疊加圖

圖2 成品對(duì)照特征圖譜

3 討論

采用二級(jí)陣列檢測(cè)器，對(duì)供試品檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，考察200～400 nm全波長(zhǎng)掃描，并重點(diǎn)考察在230、283、320 nm波長(zhǎng)處的色譜圖，結(jié)合DAD三維圖及基線的波動(dòng)程度、色譜峰的數(shù)目、信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)弱，確定230 nm 為最佳波長(zhǎng)?？疾炝肆鲃?dòng)相：1）甲醇-水系統(tǒng)，線性洗脫。2）乙腈-水系統(tǒng)，線性洗脫。3）甲醇-磷酸水系統(tǒng)，非線性洗脫。流動(dòng)相3）系統(tǒng)較好，并在此系統(tǒng)下進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化[10-17]。益腎補(bǔ)骨液主要色譜峰與其組方藥味間有較好的相關(guān)性，采用該法可幫助確定藥效部色譜峰的歸屬，進(jìn)一步分析益腎補(bǔ)骨液化學(xué)組成及來源，可為益腎補(bǔ)骨液的質(zhì)量控制提供理論保證。

[1]楊獻(xiàn)玲,徐多多,高陽,等.高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 32(4):701-703.

[2]徐建,徐云,王鑫,等.骨骼風(fēng)痛片中雞血藤高效液相特征圖譜研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 29(5):928-930.

[3]李紅梅,佟志軍,孫麗,等.滿山紅中黃酮類成分液相色譜指紋圖譜研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 32(4):708-710.

[4]魏穎,王東超,高佳琪,等.HPLC-DAD 法同時(shí)測(cè)定糖痹康中6 種主要活性成分[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016,32(6):1135-1138.

[5]江潔怡,董玉娟,李養(yǎng)學(xué),等.桂枝配方顆粒的HPLC 指紋圖譜研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30(6):1015-1018.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015:105.

[7]馮冰,陳婷. HPLC測(cè)定復(fù)方昆丹膠囊中芍藥內(nèi)酯苷,芍藥苷,二苯乙烯苷,五沒食子酰葡萄糖[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜質(zhì), 2012, 18(7):112-116.

[8]劉巖. HPLC法測(cè)定參蘇片中柚皮苷的含量[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30(3):417-427.

[9]付玉梅,張俐偉,伍振峰,等.陳皮藥材水提物的HPLC特征指紋圖譜研究[J].中成藥, 2006, 28(1):8-10.

[10]張琦,王鎮(zhèn)中,蕭偉,等.白芍藥材UPLC特征指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(6):712-714.

[11]張志海,王彩云,楊天鳴,等.陳皮的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志, 2005, 20(1):47-48.

[12]彭雙,韓立峰,王濤,等.骨碎補(bǔ)中的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 31(2):122-125.

[13]孫桂波,紀(jì)鳳蘭.何首烏的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 23(4):105-106.

[14]彭銳,馬鵬,李龍?jiān)?等.不同產(chǎn)地川黨參藥材的HPLC指紋圖譜[J].中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(2):183-186.

[15]楊來英,崔芳,吳國(guó)泰,等.當(dāng)歸藥材不同提取部分的指紋圖譜分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(13):55-60.

[16]鄢海燕,鄒純才.瓜蔞薤白顆粒的高效液相色譜特征圖譜及與組方藥味的相關(guān)性[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2013,33(4):276-280.

[17]王海麗,潘薇,張國(guó)躍,等.兒童回春顆粒HPLC特征圖譜研究[J].藥物分析雜志, 2016, 36(9):1689-1695.