劉滿光，路文雅，李國松

(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061；2.河北省林木良種工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050061；3.河北省林木種苗管理站，河北 石家莊 050091)

油松Pinustabulaeformis是我國非常重要的造林和園林綠化樹種。油松枯梢病(Sphaeropsissapinea)是油松主要病害之一，該病又稱潰瘍病，分布廣泛，危害嚴重，發(fā)病癥狀主要有葉枯、流脂、芽枯及梢枯等，可危害幼苗及大樹的嫩葉、嫩枝、嫩芽和幼果等，影響松樹的生長和產(chǎn)量，嚴重時導(dǎo)致整株樹木枯死[1-2]。目前，油松枯梢病主要采取化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥存在污染環(huán)境、持效性差以及易產(chǎn)生抗藥性等問題。

亞磷酸鹽是一種非農(nóng)藥化合物，由亞磷酸與堿反應(yīng)合成，常用作還原劑和農(nóng)藥中間體，不僅可以作為肥料被植物吸收利用，而且具有誘導(dǎo)性抗病功能[3]，它可以在病菌入侵時刺激植株產(chǎn)生植物防御素，從而預(yù)防病蟲害，增強樹勢。亞磷酸鹽在植物體內(nèi)持效期長[4]，因此具有持久的肥效和殺菌特性。目前，亞磷酸鹽已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫霉菌Phytophthora的防治[5]，對玉蜀黍赤霉Gibberellazeae、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae及禾谷絲核菌Rhizoctoniacerealis均有抑制效果[6]。據(jù)報道，亞磷酸鉀是多種殺菌劑及肥料的活性成分，但其對油松病害防治效果鮮有報道。

作者通過室內(nèi)采用菌絲生長速率法和凹玻片法測定亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制作用，林間施用亞磷酸鉀復(fù)配劑后測定油松樹干單位電容、松針鉀(K)、磷(P)元素含量、超氧化物歧化酶(SOD)及多酚氧化酶(PPO)活性，旨在為防治油松枯梢病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea由河北省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護研究所實驗室分離保存?zhèn)溆?；油松枯梢病松針采自秦皇島聯(lián)峰山公園。

供試藥劑：亞磷酸鉀(K2HPO3)、硝酸銨(NH4NO3)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸(HNO3)，天津希恩思生化科技有限公司；杰效利(非離子表面活性劑)，邁圖高新材料(南通)有限公司；K、P標準溶液(濃度均為1 000 mg/L)，信陽時得佳實業(yè)有限公司。

儀器設(shè)備：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、人工氣候箱、LCR電橋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、微波消解儀、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、組織破碎儀、冷凍離心機等。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長的測定 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將亞磷酸鉀試劑配成5個濃度梯度(表1)的母液備用。采用菌絲生長速率法[7]，將10 mL母液倒入滅菌熔融狀態(tài)的90 mL PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻凝固。用直徑5 mm的打孔器在已培養(yǎng)3 d的油松枯梢病原菌菌落邊緣取菌餅，接種于含試劑PDA培養(yǎng)基中間，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3，5，7 d后，十字交叉法測量菌落直徑取平均值。每處理重復(fù)3次，以加10 mL無菌水的培養(yǎng)基為對照。計算亞磷酸鉀對菌絲生長的抑制率。

菌絲生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

菌絲生長抑制率(%)=(1-試劑處理菌落增長直徑/對照菌落增長直徑)×100

1.2.2 孢子萌發(fā)的測定 取適量油松枯梢病松針用無菌水沖洗干凈，0.1%的升汞表面消毒30 s，無菌水沖洗3次，放置在無菌培養(yǎng)皿中，用接種針挑取其成熟的分生孢子器，輕輕按壓，并加入適量無菌水浸泡，使分生孢子完全釋放于無菌水中，配成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液，存于-4 ℃冰箱中備用。采用凹玻片法[8]，將孢子懸浮液及配好的5.6，11.2，22.4 g/L 3個濃度梯度的亞磷酸鉀藥液各0.02 mL，滴于蓋玻片上混勻，翻轉(zhuǎn)平放于凹玻片凹槽上，放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜保濕，置于25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫光照培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，無菌水為對照。每隔8 h鏡檢1次，共3次。每個載玻片觀察5個視野，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量，計算萌發(fā)率及萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(1-試劑處理孢子萌發(fā)量/對照孢子萌發(fā)量)×100

1.2.3 林間樹干單位電容測定 亞磷酸鉀20%、硝酸銨10%、硫酸鎂4%、杰效利1%以及水65%進行復(fù)配，在河北省秦皇島市聯(lián)峰山公園內(nèi)，選擇油松枯梢病均勻的油松地塊，用自流式樹干注藥技術(shù)施藥[9]。復(fù)配藥劑注射量1.0 mL/cm(胸徑)。試驗組記為T1，對照組為清水，記為CK。參照梁軍[10]的方法用LCR電橋測定并記錄樹干電容，時間為5月6日至10月21日，每14 d調(diào)查1次，共13次。樹干電容與樹木胸徑的比值即為單位電容(nF/cm)。

1.2.4 鉀、磷含量的測定 經(jīng)1.2.3中復(fù)配劑施藥后，采集試驗組和對照組油松松針，去除根部毛蒂，放在80 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中5 h，涼至室溫，用料理機粉粹至粉末狀，量取0.4 g于微波消解儀的消解罐內(nèi)，加硝酸10 mL，消解后趕酸，定容至50 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定結(jié)果，試驗時間為5月6日至10月21日，每28 d測1次，共7次。鉀分析線766.4 nm，磷分析線178.2 nm。

1.2.5 酶活性的測定 經(jīng)1.2.3中復(fù)配劑施藥后，采集試驗組和對照組油松松針，每次稱取0.2 g，表面沖洗干凈，再用無離子水沖洗2～3次，吸水紙吸干表面水分。酶液提取參考羅廣華的方法[11]，SOD活性測定參考植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[12]的氮藍四唑(NBT)法，PPO活性測定參考張茜[13]的方法。試驗時間5月6日至10月21日，每14 d測1次，共13次。酶活性單位μg/g。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel軟件整理錄入數(shù)據(jù)，DPS 7.05、SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌菌絲生長的影響 5種濃度亞磷酸鉀對油松枯梢病菌菌絲的生長均有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增大，隨時間的延長而下降，其中，濃度28 g/L，第3天的抑制率最大，為95.51%(表1)。毒力回歸方程表明對菌絲生長的EC50隨時間的增加而增大，3天的EC50最小，為7.360 g/L(表2)。

表1 亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌菌絲生長的抑制

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。

表2 亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌菌絲生長的EC50

2.2 亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌孢子萌發(fā)的影響 各濃度亞磷酸鉀對油松枯梢病菌的孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增大，隨時間的延長而增加，其中，藥劑濃度22.4 g/L，24小時的抑制率最大，為50.84%(表3)。毒力回歸方程表明孢子萌發(fā)抑制率的EC50值在24 h內(nèi)隨時間的增加而減小，24 h時EC50值最小，為19.058 g/L(表4)。

表3 亞磷酸鉀對油松枯梢病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。

表4 亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌孢子萌發(fā)的EC50

2.3 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松樹體干部單位電容的影響 試驗開始時試驗組與對照組單位電容無顯著性差異，均隨時間的延長呈先上升后下降趨勢(圖1)。對照組單位電容7月15日達到最高值，為0.998 nF/cm；試驗組單位電容7月29日達到最高值，為1.191 nF/cm，且自6月3日開始試驗組單位電容均顯著高于對照組，說明亞磷酸鉀復(fù)配劑有增大樹體干部電容的作用，且持效期較長。

圖1 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松樹體干部單位電容影響

2.4 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松松針K、P元素含量的影響 對照組K元素含量隨時間的延長先下降后上升，試驗組則隨時間的延長先上升后下降(圖2)。對照組與試驗組P元素含量均隨時間的延長先下降后上升(圖3)。試驗開始時對照組K、P元素含量均高于試驗組，7月1日后試驗組均高于對照組。試驗結(jié)束時對照組K元素的含量降低了47.47%，P元素含量降低了51.43%；試驗組K元素含量降低了26.83%，P元素含量降低了19.35%。

圖2 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松松針K元素含量影響

圖3 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松松針P元素含量影響

2.5 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松SOD及PPO活性的影響 試驗開始時試驗組與對照組SOD活性無顯著性差異，變化趨勢基本一致，均隨時間的延長先降低后升高，其中7月15日SOD活性最低，分別為387.95 μg/g和651.11 μg/g。方差分析表明，5月20日至8月26日試驗組SOD活性顯著高于對照組，8月26日后差異不顯著(圖4)。試驗開始時試驗組與對照組PPO活性無顯著差異，變化趨勢基本一致，隨時間的延長整體均呈上升趨勢。方差分析表明，6月3日后試驗組PPO活性顯著高于對照組，10月21日達到13.37 μg/g(圖5)。

圖4 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松松針SOD活性影響

圖5 亞磷酸鉀復(fù)配劑對油松松針PPO活性影響

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，亞磷酸鉀對油松枯梢病原菌菌絲生長及孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，抑制效果均隨藥劑濃度的增加而增大，對菌絲生長的抑制率可達90%以上，對孢子萌發(fā)抑制率可達50%以上，這與亞磷酸鹽可直接作用于病原菌[14]的研究結(jié)果相似，但其抑菌機制還需進一步研究。試驗組樹干單位電容高于對照組，且K、P含量較對照組穩(wěn)定，說明亞磷酸鉀復(fù)配劑能夠增大樹體干部單位電容，同時能被油松吸收轉(zhuǎn)運，為其補充K、P元素。試驗組SOD及PPO活性均高于對照組，說明亞磷酸鉀復(fù)配劑可以促進SOD活性升高，能夠在短時間內(nèi)增強抗性，同時能顯著提高PPO活性，且持效期較長，能夠長時間提高油松抗性，增強樹勢。

試驗中油松松針SOD活性呈先下降后上升趨勢，可能是由于5月到7月中旬比較適合油松生長，此時油松體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，植物體內(nèi)活性氧自由基的濃度較低[15]，所以SOD活性下降；隨著氣溫逐漸下降，油松體內(nèi)的生理代謝活動減弱，打破了活性氧的產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，使植物體內(nèi)積累了較多的自由基，此時SOD活性升高。試驗中PPO活性整體呈上升趨勢，氣溫升高，PPO活性也上升，原因是PPO酶活性與油松的抗熱、抗旱性相關(guān)；隨著氣溫的逐漸降低，松針逐漸衰老，此時PPO活性升高是油松松針抗寒性的反應(yīng)，同時可以防御病蟲害，增強抗性。

本試驗利用亞磷酸鉀等多種化合物復(fù)配，對病害的抑制及樹勢的增強具有協(xié)同增效作用，且復(fù)配劑所用原料對環(huán)境無污染、無殘毒，配制工藝簡便，成本較低，生產(chǎn)效率高，為開發(fā)防治油松枯梢病、提高油松樹勢的環(huán)境友好型試劑奠定了基礎(chǔ)。