陳偉 孫楊 王清華 王海英 高莉敏

摘要：以大蔥未開放花蕾為試材，研究花蕾大小、培養(yǎng)基、外源激素濃度配比不同對(duì)大蔥離體雌核誘導(dǎo)單倍體的影響，旨在建立大蔥離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體技術(shù)體系。結(jié)果表明：直徑為2.0～2.5 mm的未開放花蕾為最適外植體;在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA時(shí)，其雌核發(fā)育胚誘導(dǎo)率可達(dá)3.5%;在B5培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA時(shí)，其雌核發(fā)育胚誘導(dǎo)率可達(dá)2.5%。將雌核發(fā)育胚轉(zhuǎn)移至不含外源激素的1/2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，可發(fā)育成完整植株。通過根尖染色體計(jì)數(shù)分析，136株再生植株中有15株為單倍體，單倍率11%。由單倍體加倍獲得的雙單倍體是重要性狀遺傳分析、分子標(biāo)記及數(shù)量性狀研究的理想材料，此研究可為大蔥遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大蔥;雌核發(fā)育;誘導(dǎo);單倍體

中圖分類號(hào)：S633.103.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）12-0010-06

大蔥（Allium fistulosum L.）是典型的異花授粉作物，育成優(yōu)良自交系至少需要6～10年的時(shí)間。而通過單倍體途徑在較短時(shí)間內(nèi)就可以選育出整齊一致的純系，同時(shí)由于不存在等位基因位點(diǎn)的顯隱性作用，一些由隱性基因決定的性狀便可以得到充分表現(xiàn)，這樣在篩選育種材料時(shí)能大大降低誤選頻率，明顯提高選擇效果。此外，單倍體培養(yǎng)可以快速獲得雙單倍體群體。利用突變技術(shù)來創(chuàng)造有用變異已被實(shí)踐證明是一種非常有潛力的育種方法，而在離體培養(yǎng)中，雙單倍體技術(shù)則是促進(jìn)突變技術(shù)應(yīng)用的更有效的方法，至今全世界已在150多種植物中選出近2 000個(gè)優(yōu)良突變品種在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[1]。

關(guān)于未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究，最早的工作始于20世紀(jì)50年代，但直到70年代末才出現(xiàn)了研究成功的報(bào)道。San Noeum[2]利用大麥未受精子房在離體條件下培養(yǎng)獲得了單倍體再生植株，并首次釆用了“雌核發(fā)育”（gynogenesis）一詞來說明在離體條件下由未受精胚囊產(chǎn)生單倍體植株的現(xiàn)象。從此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開始對(duì)各種植物的離體雌核發(fā)育展開研究。顏昌敬與趙慶華[3]在進(jìn)行水稻葉鞘與枝梗愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的研究時(shí)，也由子房培養(yǎng)獲得了小植株。借助單倍體技術(shù)我國(guó)已成功育成水稻品種近百個(gè)，小麥品種十多個(gè)，玉米、大白菜、油菜品種多個(gè)，以及甜椒、煙草和果樹等新品種，總計(jì)種植面積超過200萬公頃，是世界上借助單倍體技術(shù)育成品種最多、應(yīng)用最廣的國(guó)家[4]。

目前，關(guān)于大蔥離體雌核誘導(dǎo)單倍體研究還未見報(bào)道。本課題主要研究在大蔥雌核離體培養(yǎng)過程中，花蕾大小、培養(yǎng)基類型、外源激素添加對(duì)雌核發(fā)育和胚狀體誘導(dǎo)的影響。本研究結(jié)果可為大蔥雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體再生體系的建立提供理論依據(jù)，并為大蔥雜交種選育、分子標(biāo)記研究、遺傳圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料的獲取

大蔥品種魯蔥雜5號(hào)，由本課題組選育。2015年7月5日播種于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)基地，同年10月8日將蔥苗定植于溫室大棚中，次年3月中旬抽薹后取材。分別選取直徑2.0～2.5、2.5～3.5 mm兩種大小的未開放花蕾作為試材。

1.2?試驗(yàn)材料的處理和培養(yǎng)

選材后剪去花柄，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精溶液表面消毒30 s，再用有效濃度5%（體積比）的NaClO消毒15 min，然后用無菌水沖洗3遍，最后用滅菌濾紙吸干表面水分，分別接種在不同外源激素濃度配比的B5和MS培養(yǎng)基中（表2和表3）。

培養(yǎng)條件：溫度（24 ± 2）℃，光照強(qiáng)度25 μmol·m-2·s-1，光周期15 h·d-1。

所有誘導(dǎo)培養(yǎng)基均添加100 g·L-1蔗糖和7 g·L-1植物凝膠，然后將其pH值調(diào)至5.8，并于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。用直徑90 mm的培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng)基，Parafilm石蠟?zāi)し饪?，每處理接種20個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種花蕾20個(gè)，即每個(gè)處理接種400個(gè)花蕾。

1.3?植株再生

花蕾在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成為胚狀體，待芽生長(zhǎng)至大約1 cm后轉(zhuǎn)入無植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、含有30 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中發(fā)育成完整植株。植株生長(zhǎng)至兩葉一心后，打開瓶蓋馴化培養(yǎng)3～5 d，用鑷子小心地將幼苗取出用自來水沖洗干凈，移栽到裝有高溫滅菌蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)成活后定植于溫室中。

胚狀體誘導(dǎo)率（%）= 有胚狀體發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.4?倍性鑒定

染色體計(jì)數(shù)法：每株取2～3 mm長(zhǎng)的新生幼嫩根尖進(jìn)行染色體鑒定，經(jīng)卡諾氏液固定過夜后，使用70%的酒精在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｇ腥〉母獠糠钟?%的醋酸洋紅染色，覆上蓋玻片，用鑷子一端垂直輕輕敲片，使染色體散開。在顯微鏡下觀察，選取染色體分散較好的體細(xì)胞拍照，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?花蕾在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的發(fā)育過程

接種在添加不同濃度外源激素的培養(yǎng)基中的花蕾2 d后陸續(xù)開放，伸出花絲，5 ～ 6 d 后花藥敗育，15 d左右子房開始逐漸膨大，珠被表面開始發(fā)白發(fā)亮。大約50 d后，從子房中長(zhǎng)出雌核發(fā)育的胚，之后胚逐漸增多，直到5個(gè)月后很少再出現(xiàn)成胚。

2.2?花蕾大小對(duì)離體雌核誘導(dǎo)單倍體的影響

分別將直徑為2.0～2.5 mm和2.5～3.5 mm的未開放花蕾接種在培養(yǎng)皿中，每皿接種20個(gè)，5個(gè)月后統(tǒng)計(jì)出胚率。由表1可以看出，在培養(yǎng)基B5和MS中，直徑為2.0～2.5 mm的未開放花蕾誘導(dǎo)出的胚狀體個(gè)數(shù)明顯高于直徑為2.5～3.5 mm的未開放花蕾胚狀體誘導(dǎo)數(shù)。所以，進(jìn)行大蔥離體雌核誘導(dǎo)單倍體時(shí)，要注重對(duì)花蕾大小的選擇，這樣可提高再生植株的誘導(dǎo)頻率。

2.3?不同培養(yǎng)基及外源激素濃度對(duì)離體雌核誘導(dǎo)單倍體的影響

以B5和MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源激素，進(jìn)行大蔥離體雌核單倍體誘導(dǎo)。由表2可以看出，在添加了1.0 mg·L-12，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA的B5培養(yǎng)基中，其雌核發(fā)育胚總誘導(dǎo)率可達(dá)2.5%。由表3可以看出，在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-12，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA時(shí)，其雌核發(fā)育胚總誘導(dǎo)率最高，可達(dá)3.5%。表明這兩種培養(yǎng)基比較適合大蔥離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)成胚，其中MS培養(yǎng)基更適合大蔥離體雌核誘導(dǎo)單倍體。

2.4?植株再生及倍性鑒定

將胚狀體轉(zhuǎn)移到未添加外源激素的含有30 g·L-1蔗糖的B5培養(yǎng)基中，發(fā)育成136棵完整植株。個(gè)別植株存在分蘗現(xiàn)象，也就是說可以由一株變?yōu)閮芍晟踔粮嘀?，所以本試?yàn)中胚狀體誘導(dǎo)數(shù)目和成苗數(shù)不統(tǒng)一，有增加現(xiàn)象的就屬于這種情況，另有些減少情況的基本是胚狀體沒有成苗。

以正常二倍體大蔥為對(duì)照，對(duì)試驗(yàn)所得再生植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)部分植株的根尖染色體細(xì)胞含有8條染色體，誘導(dǎo)再生的136棵植株中有15株為單倍體，單倍體率達(dá)11%。

3?討論與結(jié)論

在利用未授粉子房、胚珠離體培養(yǎng)單倍體方面，已在黃瓜[5]、甜瓜[6，7]、西葫蘆[8，9]等許多蔬菜作物上成功報(bào)道;在蔥屬植物研究中也取得了一定的成果，如田慧橋等[10]研究了韭菜未傳粉子房的培養(yǎng)及單倍體胚胎發(fā)生和植株再生;劉穎穎等[11]對(duì)大蒜進(jìn)行了未受精子房離體培養(yǎng)，獲得了單倍體植株;劉冰江等[12]進(jìn)行了洋蔥離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體研究，并獲得了洋蔥單倍體植株。本研究以大蔥未開放花蕾為外植體成功獲得了單倍體植株。

在利用離體雌核誘導(dǎo)單倍體過程中，外植體發(fā)育程度是一個(gè)重要的影響因素，對(duì)于子房接種適宜時(shí)間節(jié)點(diǎn)的界定，不同作物的結(jié)論相差很大。大麥胚珠離體培養(yǎng)時(shí)，在胚囊快成熟的時(shí)期容易誘導(dǎo)出單倍體植株，但誘導(dǎo)率最高出現(xiàn)在單核至四核胚囊時(shí)期[2]。洋蔥從大孢子母細(xì)胞至成熟胚囊期的整個(gè)過程中都能誘導(dǎo)單倍體植株[13，14]。目前尚未見大蔥花蕾直徑大小與胚囊發(fā)育時(shí)期關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，而且大蔥品種不同、花蕾屬于成株開花還是半成株開花，其花蕾直徑大小與胚囊發(fā)育時(shí)期的關(guān)系應(yīng)該也不相同。本試驗(yàn)針對(duì)魯蔥雜5號(hào)品種半成株開花時(shí)期的花蕾大小進(jìn)行研究，當(dāng)花蕾直徑為2.0～2.5 mm時(shí)誘導(dǎo)單倍體成功率較高。

大蔥離體雌核誘導(dǎo)單倍體成功與否，培養(yǎng)基和外源激素起著至關(guān)重要的作用。大多未受精子房或胚珠培養(yǎng)通常采用Miller、N6、MS、H、White或其改良型培養(yǎng)基加上適宜濃度的外源激素進(jìn)行培養(yǎng)[15]。劉穎穎等[11]篩選出的適宜大蒜未受精子房離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：B5+2 mg· L-1 6-BA+1 mg· L-1NAA;關(guān)于洋蔥離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的研究較多，篩選到的培養(yǎng)基各不相同，劉冰江等[12]篩選出的適宜培養(yǎng)基為含有1.5 mg· L-1 2，4-D+1.5 mg· L-1 6-BA或2.0 mg· L-1 2，4-D+2.0 mg· L-1 6-BA的B5培養(yǎng)基，Yarali等[16]篩選出的適宜培養(yǎng)基為BDS+2 mg· L-1 2，4-D+1 mg· L-1 6-BA，Michalik等[17]篩選出的適宜培養(yǎng)基為B5或BDS+2.0 mg·L-1 2，4-D+2.0 mg·L-1 6-BA。本試驗(yàn)采用B5和MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D和6-BA進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出的適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 6-BA以及B5+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA，這兩種培養(yǎng)基都能有效地刺激大蔥離體雌核的發(fā)育。

單倍體只有加倍成為雙單倍體才能應(yīng)用于育種實(shí)踐。本試驗(yàn)通過對(duì)再生植株進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)其中既有單倍體也有二倍體。之前類似的研究中也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)單倍體所獲得的再生植株經(jīng)檢測(cè)，大多是單倍體、二倍體甚至多倍體都存在。通過西葫蘆未受精子房離體培養(yǎng)獲得的再生植株，其中二倍體植株占60%[18];而利用黃瓜胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，再生植株的單倍體率僅為18.2%[19]?？梢姡参飭伪扼w培養(yǎng)中廣泛存在著染色體自然加倍現(xiàn)象，但其原因和加倍的具體時(shí)期尚不明確。有的材料自然加倍率可達(dá)10%，而有的材料幾乎不發(fā)生自然加倍[20]，這些都說明非單倍體率在不同作物間存在顯著差異。Keller和Armstrong曾提出小孢子胚自然加倍與胚胎發(fā)生初始的核內(nèi)有絲分裂相關(guān)[21]，而小麥的游離小孢子培養(yǎng)研究則證明再生植株的自然加倍率與外植體的預(yù)處理方式也有密切關(guān)系[22]。本研究中大蔥離體雌核誘導(dǎo)培養(yǎng)的單倍體率較低，僅為11%，其余的二倍體屬于自然加倍形成的雙單倍體還是體細(xì)胞形成的普通二倍體植株，尚無有效的鑒定方法。在下一步研究工作中，將結(jié)合胚珠發(fā)育的全過程細(xì)胞組織學(xué)研究和再生植株自交后代性狀觀察，深入分析再生植株來源和染色體自然加倍現(xiàn)象。

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