溫寧馨 祖凌云 王貴松 牛杰 張永珍 韓江莉 崔鳴 高煒

急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevated myocardial infarction， STEMI）是心血管疾病中的一個嚴重臨床類型。臨床上對于STEMI患者行急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）時，如血栓負荷較重，通常行血栓抽吸以減少梗死相關動脈（infarctrelated artery，IRA）的慢血流 /無復流的發(fā)生［1］。血栓抽吸所得的IRA局部血液為研究心肌梗死血管局部微環(huán)境及活性物質(zhì)提供了 “犯罪現(xiàn)場”的真實資料。

微粒是從細胞表面以出芽的方式產(chǎn)生的具有雙層膜結構的微小囊泡，直徑范圍0.4～1μm。微粒膜表面攜帶著大量受體/配體，囊泡內(nèi)含有蛋白、mRNA、microRNA等。微?？梢耘c靶細胞通過受體/配體方式結合，激活靶細胞相關信號通路；或直接與靶細胞融合，將自身攜帶的生物活性物質(zhì)轉移到靶細胞內(nèi)，影響靶細胞的生物行為［2］。因此，微粒是介導體內(nèi)病理生理過程的重要信使。我們團隊的前期研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者行急診PCI術后血漿中不同來源微粒隨著心肌梗死時程的動態(tài)變化［3］，因此推測微粒在急性心肌梗死的病理生理進展過程中發(fā)揮了重要作用。

microRNA是微粒的重要內(nèi)容物，是一類內(nèi)源性長度為 22 nt的非編碼小分子RNA。microRNA可以通過作用于相應的靶mRNA調(diào)控基因表達，在許多疾病的發(fā)病機制中起著重要的調(diào)控作用［4］。microRNA是微粒內(nèi)發(fā)揮病理生理作用的重要組成成分。為了進一步明確微粒在急性心肌梗死的病理生理進展過程中的作用，本研究提取了急性心肌梗死血栓抽吸所得的冠狀動脈內(nèi)局部血液及外周血樣中的微粒，通過基因芯片測序篩選微粒的microRNA表達譜差異，并對其功能及可能作用的靶點進行分析和預測，以便為進一步深入研究微粒在急性心肌梗死局部微環(huán)境中的病理生理機制提供線索。

1 對象和方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2014年6月至2017年6月于發(fā)病12 h 內(nèi)在北京大學第三醫(yī)院行直接 PCI 的 STEMI患者，按標準Judkins法經(jīng)股動脈或橈動脈入路行冠狀動脈造影檢查，確認IRA，根據(jù)造影判定血栓負荷較重（TIMI血栓分級≥Ⅱ級）［5］，預計置入支架前行血栓抽吸的患者（STEMI患者于行急診PCI前入選并填寫知情同意書，如果病情不需要行血栓抽吸，則自動退出）。STEMI 的診斷符合中華醫(yī)學會心血管病學分會2010年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》診斷標準［6］。排除標準：（1）患者合并急慢性感染、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、嚴重出血、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴重創(chuàng)傷、非動脈粥樣硬化導致的急性心肌梗死等情況；（2）發(fā)病前服用抗血小板藥物1周以上的患者；（3）非ST段抬高型心肌梗死患者；（4）既往陳舊性心肌梗死者。患者通常進行血栓抽吸2～4次，留取血樣10～15 ml，同時留取外周血樣（橈動脈或股動脈穿刺部位）10～15 ml。其中5例的血樣用于基因芯片檢測，25例用于其他研究。本臨床研究方案經(jīng)北京大學第三醫(yī)院臨床試驗倫理委員會批準［倫理檔案編號：PUTH-REC-SOP-06-3.0-A27（2013）醫(yī)倫申第（105-3）號］。患者均在簽署知情同意書之后入組。

1.2 研究方法

1. 2. 1 樣品處理 將血栓抽吸血樣及外周血樣予109 mmol/L枸櫞酸鈉1︰9全血抗凝，4℃暫存；后200 g，15 min離心去血細胞，并記錄紅細胞體積；13 800 g，4 min去除剩余血小板，取上清，–80℃分裝凍存。以上操作除離心外，均在無菌操作臺，且在抽吸后4 h內(nèi)完成。

1. 2. 2 微粒的鑒定和提取 將分裝血清樣品于室溫或37℃迅速溶解。根據(jù)微粒表面帶有AnnexinV及不同母細胞來源的標記，將微粒標以不同熒光標記抗體（CD144，CD45，CD41b）以及 AnnexinV 染料雙標，調(diào)整抗體比例。將500 μl標記好抗體及染料的微粒懸液與BD Trucount Tube中的粒子混勻（該粒子在任意熒光通道均可被檢測到），限定收集粒子數(shù)為1000后，在Beckman Coulter Gallious進行微粒數(shù)量及種類絕對定量。10組樣品分別取200 μl血清，以磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，100 000 g，60 min 離心，棄上清，分離得到微粒。將微粒用少量PBS沉淀重懸，將樣品吸附在碳包被的銅網(wǎng)上，使用JEM-1400 plus透射式電子顯微鏡確定分離所得微粒保持完整生理結構。按前述方法檢測，分析回收率，記錄數(shù)值，作為后續(xù)試驗校正值。

1. 2. 3 樣品總RNA抽提及質(zhì)量檢測 超速離心所得微粒加入適量Trizol，進行充分裂解，裂解后抽提RNA。使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。甲醛電泳試劑（上海康成生物工程公司提供）進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。

1. 2. 4 microRNA標記及芯片雜交 使用miRCURYTM Array Power Labeling kit標記樣品?；旌显噭?，與樣品在16℃避光孵育1 h，標記酶將Hy3TM或Hy5TM熒光基團標記microRNA，可以得到與芯片雜交的熒光探針。將以標定之熒光小核酸樣品與2×microRNA 雜交緩沖液（hybridization buffer）混合并加入適當體積純水制備樣品。樣品進行PCR加熱 95°C，2 min后，以微量吸量管加入一端樣品注入口，注入后用注入口夾子將雜交袋兩端封口。將以注入樣品之芯片置于56°C雜交烘箱中，2 r/min垂直轉速，過夜。充分雜交后，拆開雜交袋將芯片取出，并于預熱56°C清洗溶液 （buffer A）清洗2 min，buffer B室溫清洗2 min，再進行1次buffer B 2 min，25°C后，以buffer C進行室溫清洗 2 min，最后用水進行短暫清洗再以離心將芯片甩干。

1. 2. 5 數(shù)據(jù)采集及標準化 芯片經(jīng)洗滌后立即使用Axon GenePix 4000 B微陣列掃描儀掃描芯片的熒光強度，并使用GenePix Pro 6.0讀取熒光強度，去除背景后通過對每個探針上的四個平行點的均值計算得出綠色熒光信號的強度，把實驗結果轉換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存。將血栓抽吸血樣及外周血樣共10例樣品的microRNA 表達量采用中值歸一化法獲得歸一化數(shù)據(jù)到同一數(shù)量級，獲取標準表達量（standard expression）。相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均≥30.0的探針，對全部芯片進行中值標準化，篩選差異表達探針，對差異表達microRNA進行聚類并繪制聚類圖。

1. 2. 6 靶基因預測及功能分析 采用基因芯片分析所得到的具有差異的microRNA，通過miRanda，mirbase，Targetscan三大收集該物種的靶基因數(shù)據(jù)庫，將三種數(shù)據(jù)庫的結果交集作為獲得這些差異microRNA的靶基因結果。對這些差異的microRNA的靶基因使用KOBAS3.0進行GO與Pathway，Reactom，Disease注釋。從注釋結果中挑選部分感興趣的通路，反向尋找microRNA與靶基因的關系（microRNA-mRNA對應關系）最后將所得的基因運用cytoscape進行作圖。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理分析。計量資料用均數(shù)±標準差（中位數(shù)）表示，計數(shù)資料用占病例的百分比表示。對于microRNA在血栓抽吸血樣及外周血樣的微粒表達水平的比較，采用歸一化表達量=microRNA表達量/樣品總表達量×106，若microRNA表達量為0，則把數(shù)值修正為 0.01；若兩樣品microRNA 表達量都＜1，則此microRNA不能用于差異性表達分析。數(shù)據(jù)不符合參數(shù)檢驗條件，采用配對樣本的非參數(shù)秩和檢驗。數(shù)據(jù)符合參數(shù)檢驗的條件，采用樣本t檢驗。 對于microRNA表達水平的分層分析，采用獨立樣本的非參數(shù)秩和檢驗。倍比值=log2（抽吸組歸一化表達量/外周組歸一化表達量）。當倍比值≥1.5且P≤0.05時，認為 microRNA 具有統(tǒng)計學差異性表達。

2 結果

2.1 患者基線資料分析

本研究共入組2014年6月至2017年6月STEMI行血栓抽吸患者30例。患者平均年齡為56歲，男性患者26例（86.7%）；合并高血壓病14例（46.7%），高血脂13例（43.3%），糖尿病9例（30.0%）；吸煙史19例（63.3%）；左心室射血分數(shù)降低10例（33.3%）；超敏肌鈣蛋白（hs-TnT）增高28例（93.3%），平均值為（4.77±3.31）ng/ml，中位數(shù)為4.74 ng/ml；肌酸激酶（CK）增高26例（86.7%），平均值為（1889.64±1574.77）U/L，中位數(shù)為1600 U/L；肌酸激酶同工酶（CK-MB）增高25例（83.3%），平均值為（182.76±152.62）U/L，中位數(shù)為180 U/L。

2.2 提取微粒的鑒定

將分離得到的微粒沉淀以PBS輕洗重懸，于激光共聚焦顯微鏡下及冰凍顯微鏡下觀察提純微粒，可見雙層膜結構。其直徑約300 nm，符合文獻報道范圍（100～1000 nm）［7］。

2.3 RNA質(zhì)量檢測結果 （表1）

STEMI患者血栓抽吸血樣及外周血樣共10例樣本提取的微粒RNA濃度、純度及完整性均通過標準規(guī)范，可執(zhí)行進一步芯片分析。

2.4 microRNA芯片篩選結果

STEMI患者血栓抽吸血樣及外周血樣中微粒的microRNA芯片表達譜對比發(fā)現(xiàn)差異表達的microRNA共有307個，其中有221個表達上調(diào)，86個表達下調(diào)。上調(diào)microRNA包括hsa-miR-1263，hsa-miR-625-5p，hsa-miR-648，hsa-miR-4309，hsamiR-4320等；下調(diào)microRNA包括hsa-miR-634，hsa-miR-103a-3p，hsa-miR-2110，hsa-miR-125b-1-3p，hsa-miR-5581-3p等。

2.5 microRNA芯片差異表達數(shù)據(jù)聚類分析（圖1）

聚類分析結果顯示血栓抽吸5例樣本全部出現(xiàn)在同一個簇中，外周血樣中僅有1例游離于簇之外。結果證明血栓抽吸血樣及外周血樣間有較大的基因差異表達，且可能分別具有類似的生物學功能。

2.6 差異microRNA下游靶基因及功能分析（圖 2）

考慮上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)、差異有統(tǒng)計學意義以及目前相關數(shù)據(jù)庫有相應靶標預測數(shù)據(jù)等多方面綜合分析，本研究結果主要對49個與心血管疾病相關性高的microRNA進行了下游靶基因的預測和分析，發(fā)現(xiàn)他們的作用靶點廣泛，與細胞周期調(diào)控、信號轉導等都有密切關系，并且與轉化生長因子β（TGF-β）等影響心臟纖維化的信號通路都有很強的關聯(lián)性。這49個與心血管疾病相關性高的microRNA主要包括 hsa-miR-625-5p，hsa-miR-648，hsa-miR-3613-3p，hsa-miR-875-3p，hsa-miR-647，hsa-miR-155-5p，hsa-miR-137，hsa-miR-186-3p，hsa-miR-199b-5p 等。

3 討論

STEMI患者PCI術血栓抽吸的應用旨在降低遠端血栓的發(fā)生率，更有效地實現(xiàn)早期再灌注。有關血栓抽吸的早期臨床研究共納入1071例，以死亡率為次要終點的單中心試驗，其結果提示在STEMI患者中行血栓抽吸術可以減小梗死面積以及提高生存率［8］。然而納入7224例STEMI患者 TASTE 研究［9］和10732例TOTAL 研究［10］卻進一步提示 PCI術前進行血栓抽吸并不能降低患者的近期死亡率，同時未降低因心肌梗死而再入院和支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率?；谝陨辖Y果，2015年美國心臟病學會（ACC）/美國心臟協(xié)會（AHA）/心血管造影和介入學會（SCAI）對STEMI患者直接PCI指南進行了更新將常規(guī)血栓抽吸的推薦級別由Ⅱa 級降至Ⅲ級［11］。STEMI患者的IRA內(nèi)是否存在某些有益的成分，作為人體的一種代償機制促進心肌修復，而這些成分可能在血栓抽吸的同時被棄去，從而喪失心肌保護作用，進而導致了血栓抽吸的臨床獲益有限。本研究重點研究了血栓抽吸血樣及外周血樣提取微粒內(nèi)的microRNA變化，進一步明確血栓抽吸血樣內(nèi)成分與外周血樣成分的差異，試圖為進一步解釋血栓抽吸獲益有限提供線索。

2013年，瑞典卡羅琳醫(yī)學院授予James E.Rothman等三位科學家諾貝爾醫(yī)學及生理學獎，以獎勵他們“發(fā)現(xiàn)了細胞囊泡交通的運行與調(diào)節(jié)機制（for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic， a major transport system in our cells）”。這些囊泡即為微粒。微粒廣泛參與細胞的黏附、遷移、增殖、凋亡、免疫應答、血管新生、血栓形成及細胞間信息交流等過程中都發(fā)揮著重要作用。近年來，微粒病理生理作用逐漸被認識，炎癥反應、心血管疾病、腫瘤、感染及正常或病理妊娠等多種狀態(tài)均可刺激其過度產(chǎn)生［12］。微粒已被認為是一種生物標記或介質(zhì)，在多種疾病中存在并發(fā)揮作用。本課題組的團隊是國內(nèi)較早開展介入治療的心臟中心，從2010年就致力于冠狀動脈抽吸血液相關微環(huán)境信息研究，成功建立了血漿微粒檢測平臺，并已經(jīng)積累了相當數(shù)量的STEMI患者冠狀動脈內(nèi)抽吸血樣本及數(shù)據(jù)研究。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，微粒與動脈粥樣硬化具有一定的相關性，早期動脈粥樣硬化患者經(jīng)過降壓、降脂治療后，其血漿中內(nèi)皮細胞來源的微粒具有一定的抗炎作用，可以抑制單核細胞在內(nèi)皮細胞上的黏附［13］。同時，本課題組還檢測了STEMI患者行急診PCI術后血漿內(nèi)微粒水平，發(fā)現(xiàn)其在PCI術后逐漸上升，48 h達頂峰［14］。由此可以明確STEMI患者體內(nèi)確實存在微粒水平的動態(tài)變化，推測微粒參與了急性心肌梗死的病理生理發(fā)展變化。關于微粒影響靶細胞的具體機制研究一直是其熱點方向，近年來隨著microRNA逐漸進入公眾視野，越來越多研究將其與微粒中所含的microRNA聯(lián)系了起來，關于microRNA與心血管疾病的關系已經(jīng)是當前的一個研究熱點。microRNA是一類新穎的、高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，在轉錄后水平對基因表達進行負向調(diào)控，導致翻譯抑制或mRNA降解［15］?，F(xiàn)在已有證據(jù)表明microRNA所介導的基因調(diào)控在心臟自身穩(wěn)態(tài)與病理性重構中起到了重要的作用［16］。例如TGFβ1和TGFβ2可以介導microRNA-21的表達，microRNA在心臟纖維化中起著重要的作用，同時還可以抑制microRNA-30家族的表達［17］。

表1 樣品RNA濃度、純度及完整性

圖1 microRNA聚類分析

圖2 與心血管疾病相關的microRNA及其可能作用的靶基因

本研究中主要提取了STEMI患者冠狀動脈血栓抽吸血樣及外周血樣中微粒，并進一步通過基因芯片篩查并分析了microRNA表達譜的差異和其可能的下游靶點和功能。本研究發(fā)現(xiàn)上述差異表達的microRNA中有很大一部分目前還沒有關于心血管方面的研究。在所有的差異基因中，通過GO富集分析對差異基因按GO分類，并對分類結果進行基于正態(tài)分布的顯著性分析、富集度分析，得到與心血管疾病有顯著相關的hsa-miR-625-5p，hsamiR-648，hsa-miR-3613-3p等49個microRNA。通過靶基因預測軟件miRanda，mirbase，Targetscan篩查上述microRNA的作用靶基因。為了降低假陽性率，我們采用三個軟件同時預測到的基因作為主要靶基因。其中如hsa-miR-155已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)下調(diào)其水平可以減輕心臟的病理性肥大［18］；hsa-miR-212可以同時調(diào)節(jié)心臟肥大以及心肌細胞的自噬［19］。但還有許多基因如hsa-miR-199b，hsa-miR-625等目前只在癌癥領域有所涉及，對于心血管系統(tǒng)有何影響是一個很有意義的研究方向。

本研究通過收集冠狀動脈血栓抽吸血樣，進行心肌梗死相關病理生理研究分析，具有一定的創(chuàng)新性。以往對急性心肌梗死相關病理生理機制的研究多基于動物模型實驗，但是動物模型本身的局限性以及人體實際病理生理過程的復雜性，動物模型與人體存在一定差異［20］。血栓抽吸為我們獲得真實的急性心肌梗死患者微環(huán)境信息提供了珍貴的樣本。血栓抽吸所得的梗死局部血液為我們研究心肌梗死血管局部微環(huán)境及活性物質(zhì)提供了重要信息。

綜上所述，急性心肌梗死患者冠狀動脈血栓抽吸血樣與外周血樣的微粒所含有的microRNA表達具有顯著性差異，其中有49個與心血管疾病密切相關，可以作為進一步研究的靶點。本研究結果提示了急性心肌梗死患者冠狀動脈血栓抽吸血樣與外周血樣中微?？偤考捌浣M分的區(qū)別，揭示了微粒中microRNA的差異表達譜。冠狀動脈血栓抽吸血樣與外周血樣中差異的microRNA可能是導致對于血栓負荷重的患者行血栓抽吸術后并未降低死亡率及再入院率的原因之一，其機制可能是血栓抽吸血中所含有的一些對心血管系統(tǒng)有保護作用的microRNA被抽走。目前對于微粒中microRNA對于心血管疾病的影響的研究絕大部分還處于實驗室階段，如何將基礎實驗的科研結果推向臨床是將來研究中首先需要考慮的。因此對于本實驗還需要進一步擴大樣本量并對所篩查出的差異基因進一步細化分析及實驗，以期從中找出真正影響心血管系統(tǒng)的新靶點。

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