李 娜，曹 東，陳文杰，張 波，劉寶龍，張懷剛

(1.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810001； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039；3.中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810001)

千粒重、穗粒數(shù)和單位面積穗數(shù)是小麥產(chǎn)量構(gòu)成的三要素。提高小麥粒重是提高產(chǎn)量的重要途徑之一，而粒長(zhǎng)和粒寬是影響小麥籽粒大小的重要因素，同時(shí)也對(duì)小麥粒重和產(chǎn)量也有很大影響，且籽粒大小也是馴化和育種過(guò)程中的一個(gè)重要目標(biāo)性狀[1-2]。在我國(guó)小麥育種歷史中，小麥千粒重在我國(guó)不同小麥生態(tài)區(qū)，由于栽培條件和氣候等的不同，小麥產(chǎn)量的要素構(gòu)成及在產(chǎn)量中所占的比重各不相同，與其他重要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀相比，小麥粒重在我國(guó)小麥的主要生態(tài)區(qū)均被不同程度地正向選擇和提高。

GW2 基因是控制作物粒重的主效功能基因，對(duì)粒重具有較大的貢獻(xiàn)[3]。目前，Song等[4]、姜 穎等[5-6]和周 進(jìn)[7]從水稻、擬南芥、玉米和大麥中均克隆出 GW2 基因，通過(guò)分析得出該基因能夠有效地控制粒重，進(jìn)而影響產(chǎn)量。在小麥中，前人通過(guò)同源克隆法鑒定了一個(gè)與水稻 GW2 基因同源并控制小麥粒重的 TaGW2 基因，將該基因定位到6A染色體上，并根據(jù)大粒和小粒 TaGW2-6A啟動(dòng)子區(qū)存在的序列差異，開(kāi)發(fā)了以TaqⅠ限制性內(nèi)切酶為工具的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)標(biāo)記，該標(biāo)記是 TaGW2-6A的理想共顯性標(biāo)記，能產(chǎn)生大小為167 bp和218 bp的兩種片段，能很好地區(qū)分Hap-6A-A和Hap-6A-G兩種等位變異[8]。Su等[8]和韓利明等[9]的研究結(jié)果表明，Hap-6A-A是優(yōu)異等位變異，千粒重比Hap-6A-G高3 g。但是，Zhang等[10]的研究表明，Hap-6A-G是優(yōu)異等位變異，其千粒重比Hap-6A-A高8.09 g。同樣相互矛盾的結(jié)果出現(xiàn)在RNAi干擾降低Hap-6A的基因表達(dá)試驗(yàn)中。Bednarek等[11]研究認(rèn)為，RNAi干擾技術(shù)可以降低 TaGW2 的轉(zhuǎn)錄水平，與對(duì)照株系相比，轉(zhuǎn)基因株系籽粒顯著減小。敲除 TaGW2-6A后引起胚乳細(xì)胞數(shù)顯著減少。而Hong等[12]認(rèn)為 TaGW2-6A的表達(dá)量降低顯著增加了籽粒寬度和重量， TaGW2-6A負(fù)調(diào)節(jié)小麥的千粒重。通過(guò)總結(jié)前人研究結(jié)果得出， TaGW2-6A基因可能具有正向調(diào)控[11]或者負(fù)向調(diào)控[8,10,12-14]粒重的作用。這些結(jié)果的差異很有可能是由于受到材料種植的地理環(huán)境的影響所造成的。另外，寇 程等[3]利用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high resolution melting curve analysis,HRM)，檢測(cè)了316份小麥材料中 TaGW2-6A基因啟動(dòng)子區(qū)Hap-6A-A和Hap-6A-G兩種等位變異，且該方法重復(fù)好，準(zhǔn)確率高，為更加高效準(zhǔn)確地檢測(cè) TaGW2-6A基因等位變異奠定了基礎(chǔ)。

柴達(dá)木盆地海拔2 600～3 000 m，具有獨(dú)特的生態(tài)氣候條件，海拔高，云量少，日照時(shí)間長(zhǎng)，常年干旱少雨，但可以利用充足的地表水和地下水進(jìn)行春小麥的生產(chǎn)，是典型的高原綠洲農(nóng)業(yè)區(qū)。由于該地區(qū)晝夜溫差較大，有利于小麥光合產(chǎn)物的積累，且中午溫度在光合作用適宜溫度之內(nèi)，不會(huì)出現(xiàn)“午休”現(xiàn)象[15-16]，因而小麥產(chǎn)量較高，春小麥產(chǎn)量在50.0×103～56.7×103kg·hm-2的現(xiàn)象較為普遍，有記錄的60.0×103kg·hm-2以上的高產(chǎn)試驗(yàn)與示范達(dá)到30余次，并且有4次達(dá)到66.7×103kg·hm-2的水平，創(chuàng)造了我國(guó)及世界春小麥的高產(chǎn)紀(jì)錄[17]。在該地區(qū)條件下，有關(guān) TaGW2-6A基因的等位變異對(duì)千粒重的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以64份青海育成小麥品種為材料，測(cè)定了它們?cè)诓襁_(dá)木盆地的典型高產(chǎn)區(qū)青海省海西州香日德農(nóng)場(chǎng)生態(tài)條件下的千粒重，利用Hap-6A-P1/P2分子標(biāo)記檢測(cè)這些品種中 TaGW2-6A基因的等位變異，評(píng)價(jià)這些等位變異對(duì)青海省小麥育成品種千粒重的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

64份小麥品種是自1957年至2009年在青海省審定的品種(表1)，現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所農(nóng)業(yè)研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料于2010-2012年種植于青海省海西州香日德農(nóng)場(chǎng)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每個(gè)品種設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植2行，行長(zhǎng)2 m，行距20 cm，每行30粒種子，常規(guī)田間管理。待成熟后，收獲并進(jìn)行千粒重測(cè)定。

1.2.2 TaGW2-6A等位變異的檢測(cè)

將新鮮小麥葉片用液氮冷凍研磨，粉末放入滅菌的2.0 mL Eppendorf管中，用CTAB法提取基因組DNA。DNA濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，純度用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

Hap-6A-P1和Hap-6A-P2的引物序列參照Su等[8]方法，其中，Hap-6A-P1的引物序列為：5′-GTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′(正向引物)，5′-ACCTCTCGAAAATCTTCCCAAT TA-3′(反向引物)； Hap-6A-P2的引物序列為： 5′-AGAAAGGGCTGGTGCTATGGA-3′(正向引物)，5′-TAACGCTTGATAAACATAGGTA AT-3′(反向引物)，均由北京六合華大基因股份有限公司合成。TaqⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)。第二輪 PCR 產(chǎn)物測(cè)序由北京六合華大基因股份有限公司完成。Hap-6A-P1/P2引物的反應(yīng)體系和循環(huán)程序參照韓利明等[9]的方法并略作改動(dòng)：分兩步擴(kuò)增，首先用Hap-6A-P1引物擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，包括120 μmol·L-1dNTPs、每條引物4 pmol、100 ng的DNA、TaqDNA聚合酶1 U、2 μL 10×buffer、12.3 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。第一輪PCR擴(kuò)增完成后，電泳檢測(cè)出大小約1 kb的條帶。用Hap-6A-P2引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，包括125 μmol·L-1dNTPs、每條引物5 pmol、TaqDNA聚合酶1.25 U、2.5 μL 10×buffer、16.4 μL ddH2O。將第一輪PCR產(chǎn)物適當(dāng)稀釋后，作為第二輪PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完畢后用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ(按產(chǎn)品說(shuō)明操作)酶切第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物和酶切片段分別用1.5%和2.0%的瓊脂糖電泳分離。

表1 64份供試小麥品種的千粒重及 TaGW2-6A基因的等位變異類型Table 1 1 000-kernel weight and TaGW2-6A allelic variations of the 64 tested wheat varieties

2 結(jié)果與分析

2.1 青海小麥育成品種的千粒重分布

64份青海小麥育成品種的千粒重如表1所示，三年平均值為46.24 g，千粒重超過(guò)60 g的育成品種分別是高原182和高原465，其中，高原182的千粒重于2010年達(dá)到65.7 g。從變異系數(shù)來(lái)看，千粒重的變異系數(shù)較大(11%～13%)，表明64份小麥品種的千粒重遺傳變異大。

2.2 TaGW2-6A等位變異在育成品種中的分布

Hap-6A-P1/P2標(biāo)記可以有效地鑒定Hap-6A-A/G等位變異。等位變異Hap-6A-A酶切出了167 bp小片段，而等位變異Hap-6A-G酶切出了218 bp大片段(圖1)，其原因是小粒品種的第2輪PCR產(chǎn)物中有3個(gè)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ的酶切位點(diǎn)(該酶的識(shí)別序列為T(mén)CGA)，所以酶切后產(chǎn)生167 bp的小片段，而大粒品種中第三個(gè)酶切位點(diǎn)的第4個(gè)堿基發(fā)生了單堿基變異(A→G)，TaqⅠ內(nèi)切酶不識(shí)別TCGG序列，從而導(dǎo)致第三個(gè)酶切位點(diǎn)缺失，僅存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生了218 bp的大片段。在64個(gè)品種中檢測(cè)到40個(gè)(62.5%)Hap-6A-A等位變異，24個(gè)(37.5%)Hap-6A-G等位變異(表1)。

M：Maker；1：高原437；2：高原412；3：青春533；4：高原256；5：高原182；6：瀚海304；7：青春254；8：高原338。

M:Maker ;1:Gaoyuan 437;2:Gaoyuan 412;3:Qingchun 533;4:Gaoyuan 256;5:Gaoyuan 182;6:Hanhai 304;7:Qingchun 254;8:Gaoyuan 338.

圖1青海小麥品種中TaGW2-6A基因的Hap-6A-P1/P2標(biāo)記分析

Fig.1PolymorphismanalysisbymarkersHap-6A-P1/P2ontheTaGW2-6AgeneinthewheatcultivarsofQinghaiprovince

2.3 TaGW2-6A等位變異對(duì)千粒重的影響

單倍型為Hap-6A-G的品種，2010-2012年平均千粒重分別為52.78、49.66和47.54 g，而單倍型為 Hap-6A-A 的材料，千粒重僅為49.37、46.62和43.37 g，分別相差3.41、3.04和4.17 g，且差異顯著(圖2)。Hap-6A-G單倍型品種3年的千粒重平均值為49.99 g，而Hap-6A-A單倍型材料的平均值為46.46 g，相差3.54 g?？傮w而言，在青海省育成品種中，Hap-6A-G是一個(gè)優(yōu)異等位變異，但不是所有具有Hap-6A-G等位變異的材料都有高的千粒重，也不是所有的Hap-6A-A等位變異的材料都是低千粒重的。千粒重是一個(gè)數(shù)量性狀，受多個(gè)基因的影響，在其他位點(diǎn)也可能影響千粒重的形成。

圖柱上方不同字母代表差異在0.05水平顯著。

Different letters above columns indicated significant difference at 0.05 level.

圖2青海小麥品種中Hap-6A-A和Hap-6A-G單倍型的千粒重分析

Fig.21000-grainweightanalysisofHap-6A-AandHap-6A-GhaplotypesinwheatcultilarsofQinghaiprovince

3 討 論

本研究以64份青海省小麥品種為試驗(yàn)材料，統(tǒng)計(jì)分析了這些小麥品種的千粒重表型數(shù)據(jù)，并通過(guò)Hap-6A-P1/P2 功能標(biāo)記鑒定了Hap-6A-A和Hap-6A-G兩種單倍型，統(tǒng)計(jì)其在青海小麥品種的分布及分析其與千粒重的關(guān)系。已有研究表明，等位變異Hap-6A-A在澳大利亞、中國(guó)和俄羅斯的品種中占優(yōu)，而Hap-6A-G是美國(guó)、CIMMIT和歐洲的優(yōu)勢(shì)等位變異。Su等[8]以265份小麥種質(zhì)資源為材料，對(duì) TaGW2-6A基因等位變異進(jìn)行鑒定并與籽粒千粒重進(jìn)行相關(guān)分析得出，單倍型為Hap-6A-A的品種千粒重顯著高于單倍型為Hap-6A-G的材料，說(shuō)明Hap-6A-A為優(yōu)異等位變異。Zhang等[10]利用2個(gè)遺傳群體和1個(gè)自然群體為試驗(yàn)材料，對(duì) TaGW2-6A基因等位變異進(jìn)行鑒定并與籽粒千粒重進(jìn)行相關(guān)分析得出，Hap-6A-G單倍型是優(yōu)異的變異類型。而我們通過(guò)對(duì)青海小麥品種中 TaGW2-6A基因等位變異鑒定并結(jié)合千粒重表型數(shù)據(jù)得出，單倍型為Hap-6A-G的品種千粒重顯著高于單倍型為Hap-6A-A的品種，說(shuō)明青海省育成品種中Hap-6A-G等位變異占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在柴達(dá)木地區(qū)Hap-6A-G是千粒重的優(yōu)異等位變異，這與Zhang等[10]的研究結(jié)果一致，而與Su 等[8]和韓利明等[9]得到的Hap-6A-A是優(yōu)異等位變異不同。另外，千粒重被多基因所控制，且受不同環(huán)境的影響。張新業(yè)[18]認(rèn)為Su等[8]和韓利明等[9]的試驗(yàn)材料種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所河南省洛陽(yáng)試驗(yàn)站，導(dǎo)致含有Hap-6A-G的材料未能正常成熟，從而造成千粒重降低。在小麥整個(gè)生育期完全正常的情況下，Hap-6A-G是一個(gè)優(yōu)異等位變異。

Hap-6A-G和Hap-6A-A等位變異除了調(diào)節(jié)千粒重外，還能夠調(diào)節(jié)小麥的開(kāi)花期和收獲時(shí)間。韓利民等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在 TaGW2-6A位點(diǎn)攜帶Hap-6A-A等位變異的材料，主要為春性和弱冬性小麥品種，而冬性和強(qiáng)冬性品種中Hap-6A-G分布較為廣泛。攜帶Hap-6A-A等位變異的品種具有相對(duì)早熟性狀，在青海地區(qū)，早熟性狀有利于獲得高產(chǎn)小麥，因?yàn)樵谇嗪|部農(nóng)業(yè)區(qū)，晚熟會(huì)導(dǎo)致后期的高溫脅迫，而在西部農(nóng)業(yè)區(qū)，晚熟又會(huì)導(dǎo)致霜凍，從而影響產(chǎn)量。青海的育種者在選擇早熟性狀的過(guò)程中，很有可能優(yōu)先選擇了Hap-6A-G等位變異，從而導(dǎo)致在青海地區(qū)Hap-6A-G等位變異占優(yōu)勢(shì)地位。本研究通過(guò)對(duì) TaGW2-6A基因等位變異的鑒定，篩選出在青海小麥品種的優(yōu)異變異單倍型，為運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇手段來(lái)培育高產(chǎn)新品種奠定基礎(chǔ)，并可為選配親本提供理論基礎(chǔ)，加速青海小麥高產(chǎn)育種的速度。

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