李麗平，葉俊，吳舜，馬松林，周艷玲

（1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理與病理生理學(xué)系，湖北 武漢 430014；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院后湖院區(qū) 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430014）

胃癌是致死率很高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2012年全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病人數(shù)約951，000例，死亡人數(shù)高達(dá)723，000例[1]。同時胃癌也是一種高度異質(zhì)性疾病，侵襲和轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)，具有復(fù)雜的分子和組織學(xué)特征[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是在多細(xì)胞生物中發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)性RNAs，在人體內(nèi)廣泛分布，通過靶向mRNA 3’UTR觸發(fā)翻譯抑制或RNA降解[3]。越來越多的研究表明，miRNA的改變?nèi)缛笔АU(kuò)增、突變或表觀遺傳沉默等與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。由于miRNA在惡性腫瘤細(xì)胞中普遍表達(dá)異常，表明miRNAs控制抑癌基因或促癌基因，亦或是被其控制，因此miRNA的發(fā)現(xiàn)為尋找腫瘤早期診斷特異性分子標(biāo)志物及基因靶向治療提供新的方向[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，如Let-7[5]、miRNA-101[6]、miRNA-130b 等[7]。miRNA-381是miRNA家族一員，被證實參與膠質(zhì)瘤[8]、腎癌[9]及乳腺癌等[10]腫瘤生長。但是miRNA-381在胃癌中的研究還未有涉及，本研究觀察miRNA-381在胃癌細(xì)胞系及正常胃上皮細(xì)胞系中的表達(dá)及過表達(dá)miRNA-381對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MGC-803、Hs746T及BSG823和正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1（購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院），RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶及Trizol（購自美國BD公司），肝受體類似物1（liver receptor homolog-1，LRH-1）和扭曲相關(guān)蛋白1（twistrelated protein-1，Twist1）一抗（購自cell signaling公司），羊抗兔二抗（購自武漢博士德生物科技有限公司），miRNA-381 mimics及scramble（由上海吉瑪生物科技有限公司合成）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將胃癌細(xì)胞系 AGS、MGC-803、Hs746T及BSG823和正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1加入到RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)48 h后消化傳代。將AGS細(xì)胞系分成兩組，陰性對照組和miRNA-381模擬物組，采用LipofectamineTM2000 reagent（Invitrogen，USA）分別轉(zhuǎn)染 miRNA-381 scramble及 mimics，miRNA-381 mimics轉(zhuǎn)染序列：miRNA-381 mimics 正向引物：5'-UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU-3'，反向引物 ：5'-AGAGAGCUUGCCCUUGUAUAUU-3'；miRNA-381 scrramble正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3'，反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3'。

1.3 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

①miRNA-381表達(dá)量測定：用All-in-One micro RNA抽提試劑盒提取AGS、MGC-803、Hs746T、BSG823和RGM-1細(xì)胞系的miRNAs，ABI Prism 7700 system 的 SYBR Green Reagents（TaKaRa，日本 Tokyo）實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），在 ABI 7500 qRTPCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miRNA-381相對表達(dá)水平；②LRH-1和Twist1 mRNA表達(dá)量測定。

提取miRNA-381模擬物組和陰性對照組兩組細(xì)胞總RNA后，在ABI 7500實時定量PCR儀中，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列：LRH-1，正向引物：5'-CT GATACTGGAACTTTTGAA-3'，反向引物：5'-CTTCATT TGGTCATCAACCTT-3'；Twist1，正向引物：5'-AGAAGT CTGCGGGCTGTGGCG-3'，反向引物：5'-GAGGGCAGC GTGGGGAGATC-3'；GAPDH正向引物：5'-GAAGGT GAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物：5'-GAAGATGGTG ATGGGATTT-3'。使用 2-ΔΔCt方法定量，量化 LRH-1和Twist1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞增殖實驗

采用CCK-8法，將陰性對照組和miRNA-381模擬物組細(xì)胞，按2×103個/孔接種于96孔板上，按200 μl每孔標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)，在培養(yǎng)后0、24、48、72及96 h后，按每孔20 μl的標(biāo)準(zhǔn)加入CCK-8溶液，用酶標(biāo)儀在490 nm處的波長下測定各孔的光密度（optical density，OD）值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 細(xì)胞侵襲實驗

采用Transwell法，將陰性對照組和miRNA-381模擬物組兩組細(xì)胞各取2×104個細(xì)胞，接種于碳酸磷脂表面，于37℃下培養(yǎng)24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細(xì)胞結(jié)合并用0.2%結(jié)晶紫溶液染色，隨機(jī)取10個視野（×200），計算穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)3次該實驗，并取均值。

1.6 Western blot

將陰性對照組和miRNA-381模擬物組兩組細(xì)胞經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入LRH-1、Twist 1及GAPDH一抗，濃度為1∶200，一抗孵育過夜，二抗（1∶500）于37℃孵育4 h，PBST漂洗3次，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白測定值/GAPDH，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Graph軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-381在胃癌及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測miRNA-381的表達(dá)量，正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1的miRNA-381相對表達(dá)量為1.0，在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中相對表達(dá)量為（0.19±0.03），MGC-803 為（0.29±0.03），Hs746T 為（0.47±0.06），BSG823為（0.56±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計 學(xué) 意 義（F=93.260，P=0.000）；經(jīng) LSD-t檢 驗，miRNA-381在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MGC-803、Hs746T及BSG823中相對表達(dá)量均低于RGM-1（P＜0.05）。見圖1。

2.2 miRNA-381過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞AGS增殖

在AGS細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-381模擬物，用qRT-PCR檢測其相對含量變化，miRNA-381模擬物組miRNA-381相對表達(dá)量為（10.5±0.9），陰性對照組為（1.0±0.03），miRNA-381模擬物組的miRNA-381表達(dá)量高于陰性對照組（t=18.272，P=0.000）。轉(zhuǎn)染 后 0、24、48、72及 96 h，miRNA-381模 擬 物組vs對照組的OD 450 nm值分別為（0.32±0.03 vs 0.31±0.04）（t=0.346，P=0.373），（0.53±0.06 vs 0.55±0.07）（t=-0.375，P=0.363)，（1.05±0.09 vs 1.10±0.12）（t=-0.577，P=0.297），（1.49±0.15 vs 2.36±0.25）（t=-5.168，P=0.003）及（2.22±0.21 vs 3.55±0.29）（t=-6.433，P=0.000）。見圖 2。

2.3 miRNA-381過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞AGS侵襲

Transwell實驗示，200倍視野下，陰性對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（79.6±7.2）個，miRNA-381模擬物組侵襲細(xì)胞數(shù)為（31.70±4.2）個，miRNA-381模擬物組侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對照組（t=9.953，P=0.002）。見圖3。

2.4 miRNA-381下調(diào)LRH-1和TWIST1的表達(dá)

圖1 miRNA-381在胃癌細(xì)胞系及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

圖2 miRNA-381過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞AGS增殖

qRT-PCR示，miRNA-381模擬物組LRH-1 mRNA相對表達(dá)量為（0.33±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組LRH-1 mRNA相對表達(dá)量低于陰性對照組（t=25.948，P=0.000）；見圖4A；miRNA-381模擬物組Twist1 mRNA相對表達(dá)量為（0.45±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組Twist 1 mRNA相對表達(dá)量低于陰性對照組（t=-21.301，P=0.000），見圖 4B。

Western blot示，miRNA-381模擬物組LRH-1蛋白相對表達(dá)量為（0.39±0.04），陰性對照組為（1.0±0.02），miRNA-381模擬物組LRH-1蛋白相對表達(dá)量低于陰性對照組（t=-23.625，P=0.000）；見圖4C、4D；miRNA-381模擬物組Twist 1蛋白相對表達(dá)量為（0.51±0.05），陰性對照組為（1.0±0.01），miRNA-381模擬物組Twist 1蛋白相對表達(dá)量低于陰性對照組（t=-16.644，P=0.000），見圖4C和4E。

圖3 miRNA-381過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞AGS侵襲

圖4 miRNA-381下調(diào)LRH-1和TWIST 1的表達(dá)

3 討論

盡管過去幾十年中，胃癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)下降，但是胃癌仍然是世界上第4大常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的第2大原因[11]。胃癌患者預(yù)后較差，5年生存率低于30%，大多數(shù)胃癌患者的死亡是由于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)導(dǎo)致[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過調(diào)控一系列侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用[12]。在本研究顯示，在正常胃上皮細(xì)胞系中miRNA-381表達(dá)高于胃癌細(xì)胞系。更重要的是，過量表達(dá)miRNA-381能抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力，表明miRNA-381在胃癌浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑癌基因作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-381過表達(dá)引起LRH-1蛋白表達(dá)水平下降。研究證實，LRH-1是miRNA-381的靶蛋白，miRNA-381通過直接靶向LRH-1 3'-UTR抑制肝癌細(xì)胞生長和侵襲[13]。在結(jié)腸癌中，miRNA-381表達(dá)下降上調(diào)LRH-1蛋白水平促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增殖、遷移[14]。意味著LRH-1活性的增加與胃癌細(xì)胞迅速增長和增殖有一定關(guān)聯(lián)。細(xì)胞周期蛋白D1和E1（Cyclin D1和Cyclin E1）是細(xì)胞周期G1期關(guān)鍵蛋白，能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）組成Cyclin D1-CDK4/6和Cyclin E1-CDK2復(fù)合物參與調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)變[15]。Cyclin D1已被證實是一種原癌基因，其過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控和惡化[16]。Cyclin E1在多種腫瘤組織中表達(dá)較高，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17]。C-Myc基因也是一個公認(rèn)的原癌基因，在多種腫瘤中被激活，其靶基因參與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和代謝等過程中[18]。研究發(fā)現(xiàn)，LRH-1與β-catenin能夠協(xié)同共激活下游基因Cylin D1、Cyclin E1及c-Myc的表達(dá)，促進(jìn)腸腫瘤細(xì)胞增殖[19]。已有研究證實，LRH-1基因沉默降低Cylin D1、Cyclin E1及c-Myc的表達(dá)水平，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[19]。本研究中，miRNA-381表達(dá)上升導(dǎo)致LRH-1蛋白表達(dá)下調(diào)，其作用機(jī)制可能是miRNA-381直接綁定結(jié)合LRH-1 3'-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控LRH-1基因的表達(dá)。筆者推測，LRH-1與β-catenin協(xié)同共激活Cyclin D1、Cyclin E1及c-Myc的作用減弱，使G1/S期轉(zhuǎn)換受抑制，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G0/G1期，進(jìn)入S期和G2期的細(xì)胞數(shù)目減少，同時使c-Myc靶基因表達(dá)失控，降低胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞間黏附和連接能力降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫落并遷移到其他組織、器官是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[20]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過程，主要特征為細(xì)胞黏附分子的表達(dá)減少、細(xì)胞骨架及形態(tài)改變，在腫瘤浸潤和遷移過程中起關(guān)鍵作用[21]。轉(zhuǎn)錄因子Twist-1是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子，Twist-1表達(dá)上升誘導(dǎo)發(fā)生該過程，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制[22]。研究發(fā)現(xiàn)，Twist-1 3'-UTR含有大量miRNAs的調(diào)控元件，包括miRNA靶點，多個miRNAs被證實能夠抑制Twist-1的翻譯，如miRNA-145a-5p、miRNA-151-5p等[23]。據(jù)報道，miRNA-106b通過靶向Twist-1調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[24]，在結(jié)直腸癌中miRNA-381通過直接靶向Twist-1發(fā)揮抑癌作用[25]。在本研究中，miRNA-381可能通過特異性結(jié)合Twist-1 3'-UTR靶位點，降低Twist1基因翻譯水平，抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而阻礙細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上所述，miRNA-381通過抑制LRH-1和Twist-1蛋白的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。miRNA-381在胃癌中功能及其作用機(jī)制的鑒定，有望成為腫瘤早期診斷標(biāo)志物及基因靶向治療的新靶點。

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