高菲，劉文君

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，四川 瀘州 646000）

白血?。╨eukemia）是一類造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病，是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害兒童的健康[1-2]，其治療主要是以化療為主的綜合性治療，而耐藥已成為白血病治療的一大阻礙。研究發(fā)現(xiàn)，同源盒（homeobox，HOX）基因的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞分化成熟障礙、造血能力降低，最終可導(dǎo)致造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。作為HOX基因家族中的一員，HOXA5定位于7號(hào)染色體（7p15.2），其表達(dá)主要局限在粒-單核細(xì)胞系。據(jù)報(bào)道，HOXA5基因與腫瘤的耐藥性有關(guān)，但其作用機(jī)制不清[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路異常與白血病的發(fā)生、發(fā)展及其多重耐藥密切相關(guān)，其中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是白血病耐藥的重要機(jī)制之一[6-9]，其主要參與細(xì)胞的活化、生長(zhǎng)及凋亡。研究表明HOX基因與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化存在相關(guān)性[10]。因此，我們推測(cè)HOXA5基因可能通過(guò)p38MAPK通路逆轉(zhuǎn)K562/ADM的耐藥性。

RNA干擾（RNA interferene，RNAi）技術(shù)是雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后引起同向靶基因表達(dá)沉默，具有快速、特異、高效等優(yōu)點(diǎn)[11]。本實(shí)驗(yàn)建立在前期設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)HOXA5的特異性有效siRNA序列，并通過(guò)相關(guān)檢測(cè)方法篩選出對(duì)HOXA5表達(dá)抑制效率最佳的1條siRNA序列的基礎(chǔ)上[12-13]，通過(guò)RNAi技術(shù)沉默HOXA5，探討p38MAPK信號(hào)通路在耐藥白血病細(xì)胞中的作用，為耐藥白血病的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人白血病耐阿霉素細(xì)胞株K562/ADM細(xì)胞（購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司），阿霉素（購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限工司），RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清（購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司），二甲基亞砜（DMSO）（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、總RNA提取試劑盒、CCK8及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（購(gòu)自碧云天公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購(gòu)自日本ToYoBo公司），Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司），脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），靶向HOXA5的siRNA序列、陰性對(duì)照siRNA序列（杭州艾迪康公司合成），兔抗人HOXA5多克隆抗體一抗（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司），兔抗人p38MAPK及p-p38MAPK多克隆抗體一抗（購(gòu)自美國(guó)CST公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將K562/ADM細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素雙抗、1 000 ng/ml阿霉素完全培養(yǎng)基中并接種在培養(yǎng)瓶，置于5%二氧化碳CO2的37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)液并傳代，實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞用無(wú)ADM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)先分為K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞組。然后以本課題組前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)對(duì)K562/ADM細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后再分為3組：實(shí)驗(yàn)組（pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5），陰性對(duì)照組（pRNAT-GFP-Neo-siNC），空白對(duì)照組（未作任何處理的K562/ADM）。本課題組前期設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)HOXA5的特異性有效siRNA序列，并篩選出對(duì)HOXA5抑制率最高的1條序列，正向：5'-TTGCGGTCGCTATCCAAATGG-3'，反向：5'-CCATT TGGATAGCGACCGCAA-3'[12-13]。根據(jù)此序列合成靶向抑制HOXA5的特異性真核表達(dá)載體pRNAT-GFPNeo-siHOXA5，并設(shè)計(jì)合成陰性對(duì)照載體pRNATGFP-Neo-siNC。轉(zhuǎn)染時(shí)調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi)，按LipofectamineTM2000說(shuō)明書將脂質(zhì)體與表達(dá)載體在無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基中混合配成轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染K562/ADM細(xì)胞。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。收集上述各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8檢測(cè) CCK-8實(shí)驗(yàn)采用的ADM的干預(yù)濃度依次為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00及40.00 μg/ml。分別收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的ADM干預(yù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，用微量移液器吸取100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和空白調(diào)零組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再加10 μl的CCK-8溶液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用2 h，在450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的OD值。求得均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。IC50=Ig-1[Xm-i（∑p-0.5）]。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=對(duì)照IC50/實(shí)驗(yàn)IC50。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA5及P38的mRNA表達(dá) 收集上述各組細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR法擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照基因人GAPDH。HOXA5、p38及GAPDH引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為140、130及262 bp，各引物的序列見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-△△Ct的方法進(jìn)行分析，由此表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 HOXA5、p38及GAPDH引物序列

1.3.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達(dá) 分別收集上述各組細(xì)胞，按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞全蛋白。BCA法測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度取等量蛋白，加5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，經(jīng) TBST 充分漂洗（5 min，3次），HOXA5、p38及 p-p38多克隆抗體均按1∶1 000稀釋。4℃孵育過(guò)夜，充分漂洗后加山羊抗兔二抗按照1∶3 000稀釋，室溫27℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。通過(guò)Gel-Pro annalyzer軟件分析圖像，以HOXA5、p38及p-p38蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/ADM，轉(zhuǎn)染24 h后，每組再分為ADM未干預(yù)組及加濃度為2.5 μg/ml的ADM干預(yù)組。用冷PBS將上述細(xì)胞組的細(xì)胞洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè) /ml將細(xì)胞重懸于 50 μl的 Binding Buffer，并加入5 μl 7-AAD，室溫27℃，避光染色5～15 min，然后分別加入450 μl Binding Buffer混勻，再加入1 μl Annexin V-PE，室溫27℃，避光染色5～15 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.6 細(xì)胞周期的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/ADM，轉(zhuǎn)染24 h后用冷PBS將上述細(xì)胞組的細(xì)胞洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，取1 ml的單細(xì)胞懸液去除上清液，用70%的冷乙醇500 μl懸浮細(xì)胞4℃放置2 h或至過(guò)夜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，PBS洗滌去乙醇。加入RNAase 100 μl 37℃水浴30 min。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測(cè)定，結(jié)果用Multicycle software進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染K562/ADM細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，因?yàn)檗D(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒載體pRNA-GFP-Neo-siHOXA5和pRNAT-GFP-Neo-siNC帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，因此實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組在熒光顯微鏡觀察下出現(xiàn)綠色熒光，而空白對(duì)照組未見(jiàn)熒光。見(jiàn)圖1。

2.2 ADM對(duì)各組細(xì)胞的抑制作用

ADM對(duì)各組細(xì)胞均有抑制作用，各組細(xì)胞的IC50比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.325，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50與對(duì)照組比較降低（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

2.3 細(xì)胞中HOXA5、p38的mRNA表達(dá)情況

K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的mRNA表達(dá)高于K562細(xì)胞（P＜0.05）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/ADM細(xì)胞后，比較各組細(xì)胞中HOXA5 mRNA的表達(dá)量，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=122.282和172.900，均P=0.000），重組質(zhì)粒能抑制K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的mRNA表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)p38的mRNA表達(dá)經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=152.817和34.227，均P=0.001），結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較p38的mRNA表達(dá)增高（P＜0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 3、4 和圖 2。

圖1 普通倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染的各組K562/ADM細(xì)胞

表2 ADM作用下各組細(xì)胞IC50的變化

2.4 各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，K562細(xì)胞中HOXA5蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于K562/ADM細(xì)胞（P＜0.05）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后比較各組中HOXA5蛋白及p-p38的表達(dá)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1722.480和115.433，均P=0.000），實(shí)驗(yàn)組中HOXA5蛋白被抑制（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中p-p38的蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，siRNA能特異性沉默K562/ADM中的HOXA5基因，并使p38激活為p-p38，但對(duì)p38的蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.153，P=0.074）。見(jiàn)表5和圖3。

表3 HOXA5的mRNA表達(dá) （±s）

表3 HOXA5的mRNA表達(dá) （±s）

相對(duì)表達(dá)量（RQ=2-ΔΔCt）實(shí)驗(yàn)組 0.31±0.12 0.22±0.09陰性對(duì)照組 1.35±0.10 0.99±0.04空白對(duì)照組 1.37±0.06 1.00 K562 0.58±0.11 0.42±0.11 F值 122.282 172.900 P值 0.000 0.000組別 HOXA5 mRNA（目的基因/內(nèi)參照基因）

表4 p38的mRNA表達(dá) （±s）

表4 p38的mRNA表達(dá) （±s）

相對(duì)表達(dá)量（RQ=2-ΔΔCt）實(shí)驗(yàn)組 1.17±0.07 3.26±0.59陰性對(duì)照組 0.38±0.06 1.06±0.29空白對(duì)照組 0.37±0.05 1.00 F值 152.817 34.227 P值 0.000 0.001組別 P38 mRNA（目的基因/內(nèi)參照基因）

圖2 HOXA5、p38及GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞的凋亡情況

比較ADM未干預(yù)及ADM干預(yù)中各組細(xì)胞的凋亡，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.606和423.492，P=0.003和0.000）。ADM未干預(yù)及干預(yù)中實(shí)驗(yàn)組的凋亡率與對(duì)照組相比增高（P＜0.05）；ADM干預(yù)中各組細(xì)胞的凋亡率高于ADM未干預(yù)（P＜0.05），而ADM干預(yù)與ADM未干預(yù)中陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6和圖4。

2.6 siRNA特異性沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞的周期變化

各組細(xì)胞的G0/G1期和S期比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.783和70.549，均P=0.000）。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期升高（P＜0.05），而 S期降低（P＜0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G2/M期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.568，P=0.594）。見(jiàn)表7和圖5。

表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達(dá) （%，±s）

表5 HOXA5、p38、p-p38的蛋白表達(dá) （%，±s）

圖3 各組細(xì)胞中HOXA5、p38及p-p38的蛋白表達(dá)（Western blot）

表6 ADM干預(yù)下各組細(xì)胞的凋亡率 （%，±s）

表6 ADM干預(yù)下各組細(xì)胞的凋亡率 （%，±s）

圖4 細(xì)胞的凋亡情況 （FCM法）

圖5 細(xì)胞周期的變化 （FCM法）

表7 沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞周期的分布情況（%，±s）

表7 沉默HOXA5后K562/ADM細(xì)胞周期的分布情況（%，±s）

組別 G0/G1 G2/M S實(shí)驗(yàn)組 46.85±2.01 10.82±2.62 42.93±1.68陰性對(duì)照組 25.52±2.29 12.21±2.51 62.60±2.26空白對(duì)照組 27.55±1.22 11.85±3.00 60.26±2.59 F值 115.783 0.568 70.549 P值 0.000 0.594 0.000

3 討論

哺乳動(dòng)物的HOX基因在結(jié)構(gòu)上分為A、B、C、D 4個(gè)簇，依次定位于7、17、12及2號(hào)染色體上，其按照線性順序進(jìn)行表達(dá)并參與造血細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控[14]。據(jù)報(bào)道，HOX基因在許多髓系白血病樣品中高表達(dá)，但是其表達(dá)的模式和相關(guān)監(jiān)管機(jī)制并不清楚[15]。在MLL患者中能檢測(cè)到上調(diào)的HOXA基因，HOXA異常表達(dá)是造血細(xì)胞正常分化的一大障礙[16]。而HOXA5基因作為HOXA族中的一員，對(duì)白血病的發(fā)生、發(fā)展同樣具有重要影響。FULLER等[17]發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)HOXA5的K562細(xì)胞株紅細(xì)胞分化被抑制，抑制HOXA5表達(dá)有助于增高紅細(xì)胞祖細(xì)胞的分化及成熟。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOXA5基因在K562及K562/ADM細(xì)胞中高表達(dá)，且其在K562/ADM中的表達(dá)高于K562細(xì)胞，進(jìn)一步證明HOXA5的過(guò)表達(dá)與白血病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

兒童慢性髓系白血病的5年生存率（5-year event-free survival，EFS）為44%[18]，復(fù)發(fā)和耐藥是影響其生存率的重要原因，因此，進(jìn)一步研究髓系白血病的耐藥機(jī)制具有重要意義[19]。有研究表明，運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制HOXA7基因的表達(dá)在一定程度上可逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞U937的多重耐藥[20]。據(jù)報(bào)道，通過(guò)降低和提高細(xì)胞中HOXA5的表達(dá)，觀察肺癌細(xì)胞對(duì)小細(xì)胞肺癌（SCLC）常用化療藥物敏感性的變化發(fā)現(xiàn)HOXA5可能參與SCLC耐藥性的產(chǎn)生[5]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示K562/ADM細(xì)胞中HOXA5的表達(dá)增高，RNAi特異性沉默K562/ADM細(xì)胞中的HOXA5基因后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)ADM的IC50較對(duì)照組的IC50降低2.55倍。結(jié)果提示，HOXA5基因與白血病細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，沉默HOXA5基因能在一定程度上逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性，與上述報(bào)道[20，5]的研究結(jié)果相似。

CUI等[10]應(yīng)用TGF-β2抑制性抗體及p38抑制劑等干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOXA10能降低TGF-β2及MMP-3的表達(dá)并抑制p38的活化，表明HOX基因與p38的活化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中有效沉默K562/ADM細(xì)胞中的HOXA5基因后，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的p38 mRNA及p-p38蛋白表達(dá)增高。結(jié)果提示，沉默HOXA5能增強(qiáng)p38mRNA的表達(dá)，并能激活p38使其磷酸化為p-p38，與CUI等[10]的研究結(jié)果相似。

結(jié)果顯示ADM未干預(yù)及ADM干預(yù)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組增高；并且ADM干預(yù)組中各組細(xì)胞的凋亡率高于ADM未干預(yù)組。在細(xì)胞周期檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例相應(yīng)降低，說(shuō)明抑制HOXA5的表達(dá)能減緩G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，減少細(xì)胞分裂增殖。以上結(jié)果提示沉默HOXA5基因后，能在一定程度上能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，阻滯細(xì)胞的G0/G1期，減少細(xì)胞分裂增殖，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，HOXA5與K562/ADM細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。沉默HOXA5在一定程度上能逆轉(zhuǎn)白血病的多重耐藥，其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)p38的mRNA表達(dá)并使其激活為p-p38。RNAi技術(shù)沉默HOXA5基因后，激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞的耐藥性可能成為耐藥白血病治療的新靶點(diǎn)。

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