李福興，胡超，何薇，喬曉紅，謝曉恬

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院 兒科，上海 200065；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032）

抑癌基因失活可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因沉默失活的常見(jiàn)機(jī)制之一，該現(xiàn)象廣泛地存在于多種惡性腫瘤中[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中一種最為重要的修飾，是通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）來(lái)催化和維持。DNMTs包括 DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，后2個(gè)在哺乳動(dòng)物DNA甲基化中起主要催化作用[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3B在部分MDS及急性髓系白血病中呈高表達(dá)水平，且高表達(dá)患者生存期較短，化療療效不佳，預(yù)后不良，提示DNMT3B在血液腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展起重要作用[3-6]。通過(guò)基因敲除是研究基因功能的主要手段之一，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)在血液系統(tǒng)條件性敲出DNMT3B基因小鼠模型的報(bào)道，國(guó)外僅有利用Cre/loxP系統(tǒng)在細(xì)胞水平敲出DNMT3B基因的研究[7]，也有可以在腸道組織敲除DNMT3B小鼠模型相關(guān)研究[8]，尚無(wú)可以條件性在血液系統(tǒng)敲出DNMT3B基因小鼠模型的報(bào)道。本課題組利用引進(jìn)的DNMT3Bflox/flox小鼠，與Mx1-Cre小鼠交配，成功構(gòu)建可以在血液系統(tǒng)條件性敲除DNMT3B基因的小鼠，并進(jìn)行敲除后鑒定，為研究DNMT3B在血液腫瘤中的作用提供動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DNMT3Bflox/flox小鼠 [從 Fan Guoping教授（David Geffen School of Medicine，UCLA）獲得 ]，Mx1-Cre小鼠（由伊利諾伊大學(xué)芝加哥校區(qū)血液腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室保存繁育），均為C57BL/6背景。所有動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖均在伊利諾伊大學(xué)芝加哥校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

1.2 小鼠飼養(yǎng)和繁殖

按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，小鼠飼料、墊料和飲水均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理，墊料1周更換1次。采用1只雄鼠和2只雌鼠同居的方式進(jìn)行繁殖。母鼠孕期為19～21 d，哺乳期為20～22 d。

1.3 方法

1.3.1 小鼠構(gòu)建策略與流程 DNMT3Bflox/flox小鼠，是以DNMT3B基因的16～19號(hào)外顯子作為靶基因，在其兩端插入loxP位點(diǎn)（見(jiàn)圖1A），與表達(dá)Cre酶的Mx1-Cre工具鼠（見(jiàn)圖1B）交配后獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，通過(guò)注射pI-pC注射誘導(dǎo)Cre重組酶表達(dá)，切除2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，從而實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除。

1.3.2 構(gòu)建流程 DNMT3Bflox/flox小鼠與Mx1-Cre+小鼠交配后產(chǎn)生DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-2種子代，再用DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-與DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+雜交產(chǎn)生子代，最后通過(guò)PCR反應(yīng)鑒定其基因型（見(jiàn)圖1C）。

圖1 DNMT3B敲除小鼠模型構(gòu)建流程

1.3.3 小鼠基因型鑒定 剪取4周齡小鼠尾尖2～5 mm，置于1.5 ml Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解緩沖液（direct PCR lysis reagent，Viagen Biotech Inc）100 μl和 蛋 白 酶 K（proteinase K，Sigma-Aldrich）5 μl，55℃震蕩裂解過(guò)夜；然后85℃，45 min滅活蛋白酶K；室溫，12 000 r/min離心，5 min，取上清做模板可用于PCR分析。使用Sigma公司合成的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。見(jiàn)表1。

反應(yīng)體系（10 μl）：10×Titanium Taq Buffer 1 μl，模板 DNA 1 μl，正反向引物各 0.1 μl，50×Titanium Taq Polymerase 0.2 μl，4 μmol/L dNTP 0.5 μl，雙蒸水補(bǔ)足至10 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，置入4℃保存?zhèn)溆?，取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增條帶確定小鼠子代基因型。

表1 基因型鑒定的引物

使用Floxed引物擴(kuò)增，凡是能擴(kuò)增出2條帶（270和406 bp）者均為DNMT3Bflox/+，而只能擴(kuò)增出1條406 bp條帶者基因型必為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+或者DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-；再以Cre通用異物擴(kuò)增，凡是可以擴(kuò)增出301 bp條帶者為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，即可以用于DNMT3B敲除的小鼠，見(jiàn)表2。

表2 基因型對(duì)應(yīng)電泳條帶

1.3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠DNMT3B敲除效能鑒定 由于floxed小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20號(hào)外顯子中間各插入1個(gè)LoxP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)敲除后鑒定引物primer F’，位于15號(hào)外顯子，如果成功敲除，將可以擴(kuò)增出500 bp左右條帶。對(duì)DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，通過(guò)隔天腹腔注射聚肌胞苷酸（pI-pC；GE Healthcare）1次，體重10 μg/g，共5次，誘導(dǎo)DNMT3B基因的丟失。pI-pC腹腔注射完成后，第7天處死小鼠取骨髓細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒（Puregene Blood Core KitB，QIAGEN）按說(shuō)明書(shū)提取DNA，同時(shí)使用3條引物primer F，primer F’，primer R按genotyping體系和條件行PCR證實(shí)DNMT3B的敲除。

2 結(jié)果

2.1 DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+小鼠鑒定

通過(guò)DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+和DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-交配，共產(chǎn)出小鼠13只，分兩步分別進(jìn)行DNMT3Bflox/flox和Mx1-Cre基因型鑒定。

2.1.1 DNMT3Bflox/flox基因型鑒定 DNMT3Bflox/+小鼠自交所生子代DNMT3Bflox/flox、DNMT3Bflox/+、DNMT3B+/+的基因型鑒定結(jié)果，見(jiàn)圖2：僅可以擴(kuò)增出270 bp條帶的為野生型（如2號(hào)和10號(hào)），可以同時(shí)擴(kuò)增儲(chǔ)270和406 bp的為雜合子（如1，3，6，11，13號(hào)），而僅可以擴(kuò)增出406 bp條帶者為DNMT3Bflox/flox，需要的突變純合子（如4，5，7，8，9，12號(hào)）。

圖2 DNMT3Bflox/flox基因型PCR鑒定結(jié)果

2.1.2 Mx1-Cre基因型鑒定 Mx1-Cre+及Mx1-Cre-小鼠交配僅可以產(chǎn)出Mx1-Cre+和Mx1-Cre-兩種子代，其中基因型為Mx1-Cre+的子代可以擴(kuò)增出301 bp條帶（如9和12號(hào)），而基因型為Mx1-Cre-的子代無(wú)法擴(kuò)增出條帶（如1-8號(hào)，10號(hào)和13號(hào)），在獲得的13只子代小鼠中，只有9號(hào)和12號(hào)攜帶Mx1-Cre基因。見(jiàn)圖3。

圖3 Mx1-Cre基因型PCR鑒定結(jié)果

2.1.3 DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+個(gè)體獲得 綜合分析DNMT3Bflox/flox基因型和Mx1-Cre基因型鑒定結(jié)果，確認(rèn)9號(hào)和12號(hào)子鼠基因型為DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+，是可以用于敲除DNMT3B的工具鼠。

2.2 Dnmt3B敲除鑒定

對(duì)DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，隔天注射5次pI-pC后，取鼠尾組織行PCR進(jìn)行基因型鑒定，由于可以敲除DNMT3B基因，故能擴(kuò)增出500 bp的片段，用作實(shí)驗(yàn)組對(duì)象。而DNMT3Bflox/floxMx1-Cre-小鼠無(wú)法敲除DNMT3B基因，只能擴(kuò)增出406 bp的片段，可用作對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

圖4 DNMT3B敲除后PCR鑒定結(jié)果

3 討論

在哺乳動(dòng)物基因組中，CpG島甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾，不僅對(duì)個(gè)體正常發(fā)育起重要作用，還可以影響基因表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[9]。甲基化調(diào)控需要DNMTs的參與，其中DNMT3A和DNMT3B負(fù)責(zé)從頭甲基化，影響DNA的甲基化水平并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[10]。R OBERTSON等研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者DNMT3A、DNMT1及DNMT3B表達(dá)上調(diào)，且DNMT3B的表達(dá)水平升高最為顯著[11]，提示DNMT3B可能在惡性腫瘤發(fā)病中起重要作用。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，DNMT3B基因高表達(dá)與膀胱癌，胃腸道惡性腫瘤，乳腺癌、肝癌及白血病等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12-15]，目前認(rèn)為，DNMT3B可以導(dǎo)致抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[16-17]。有研究提示，DNMT3B在myc誘發(fā)的淋巴瘤和MLL-AF9誘發(fā)的AML中表現(xiàn)為抑制腫瘤作用，提示其抑癌基因?qū)傩訹18]，然而亦有研究顯示在AML患者中，DNMT3B高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[19]，提示原癌基因?qū)傩?，故DNMT3B在血液腫瘤中的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

構(gòu)建基因敲除小鼠模型，在全部組織或者特定組織中使某基因功能缺失，是闡明該基因功能最直接有效的手段之一。Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)是目前用于條件性基因敲除中最常用的系統(tǒng)工具之一。LoxP序列來(lái)源于噬菌體P1，而Cre酶是來(lái)源于噬菌體P1的一種蛋白。LoxP序列中的特殊回文結(jié)構(gòu)可以被Cre酶特異性識(shí)別結(jié)合并催化2個(gè)LoxP序列之間的片段發(fā)生同源重組，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該片段的基因敲除。如果將Cre重組酶cDNA通過(guò)基因工程的手段置于組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子之下，可以實(shí)現(xiàn)在特定組織/細(xì)胞特異性表達(dá)Cre，獲得Cre工具小鼠跟Flox小鼠交配之后，可以得到可以在特定組織細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除的小鼠[20]。

本研究為構(gòu)建DNMT3B基因條件性敲除小鼠，首先從美國(guó)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)DNMT3Bflox/flox小鼠，該小鼠在DNMT3B基因的15和16，19和20號(hào)外顯子中間各插入1個(gè)LoxP位點(diǎn)[21]。通過(guò)與血液系統(tǒng)特異表達(dá)Cre酶的Mx1-Cre小鼠雜交，獲得DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠，用pI-pC誘導(dǎo)Cre酶表達(dá)，可以在血液系統(tǒng)敲除DNMT3B核心序列，使得靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+小鼠模型的構(gòu)建為研究DNMT3B在正常造血調(diào)控及血液腫瘤中的作用機(jī)制提供合適的工具?；贑re/LoxP系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)構(gòu)建其他組織系統(tǒng)特異性CRE表達(dá)小鼠，可以通過(guò)條件敲除DNMT3B研究其在多種腫瘤中的作用機(jī)制。

志謝：感謝UCLA范國(guó)平教授慷慨提供DNMT3Bflox/flox小鼠，感謝伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校錢(qián)志堅(jiān)教授提供Mx1-cre小鼠及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，感謝黎力平博士對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)指導(dǎo)。

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