黃曉培 朱江波 常文軍 張曉芳 張?zhí)鞂?康爭春 薛偉

胃癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中居第3位［1］。近年來，隨著診斷治療水平的提高及人們飲食習(xí)慣的改變，胃癌的發(fā)病率、病死率有下降的趨勢(shì)。但由于存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的預(yù)后仍然較差。準(zhǔn)確地評(píng)估胃癌患者的預(yù)后并對(duì)預(yù)后較差的患者施以輔助化療、免疫治療等方法，可極大地改善患者的預(yù)后。目前TNM分期是最重要的評(píng)估胃癌預(yù)后的方法，但即使同一TNM分期的患者，預(yù)后仍然存在較大的差別。因此，亟待找到一種新的評(píng)價(jià)體系更好地評(píng)估胃癌患者的預(yù)后。

近年來，外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和惡性腫瘤預(yù)后的相關(guān)性成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，目前已證實(shí)NLR與胃癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)［2-4］。但其靈敏性、特異性均較差，暫未應(yīng)用于臨床作為預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)。腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANs）作為腫瘤微環(huán)境的重要成員，也已證實(shí)與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)［5］。上述研究僅是單一地分析血液或腫瘤組織中中性粒細(xì)胞對(duì)胃癌預(yù)后的影響，并不能反映中性粒細(xì)胞對(duì)胃癌的綜合影響，因而對(duì)胃癌患者預(yù)后的判斷存在較大的限制。本研究旨在探討外周血NLR聯(lián)合腫瘤組織TANs浸潤對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

隨機(jī)選取第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院2006年6月至2011年5月收治的180例胃癌患者，所有患者均行手術(shù)切除術(shù)。將其中隨訪資料完整、術(shù)前均未行放化療及其他抗腫瘤治療，且自身未患免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的126例胃癌患者納入研究。胃癌患者的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料及臨床病理學(xué)特征包括：性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、是否行輔助放化療、血清中癌胚抗原（CEA）和糖類抗原（CA199）水平。腫瘤的TNM分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）制定的胃癌TNM分期（第7版）標(biāo)準(zhǔn)確定。本研究得到第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院的科研機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均被告知并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法和指標(biāo) 患者術(shù)前一周內(nèi)采集靜脈血進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值。以NLR=4為分界點(diǎn)［6-7］，將其分為高NLR組和低NLR組。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織中CD66b抗原，判斷胃癌組織中CD66b蛋白的表達(dá)從而鑒定組織中的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞［8］。石蠟包埋的組織切片，由上海芯超生物科技有限公司制成組織芯片。65℃烤片，常規(guī)脫蠟水化，用30%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)?？笴D66b抗體（G10F5，BD Biosciences，美國，抗體稀釋倍數(shù)1:400）4℃孵育過夜。免疫組織化學(xué)試劑盒（KIF-5920，maxim，美國）用于孵育二抗及DAB顯色。隨后蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 用Aperio公司（美國）病理切片掃描成像系統(tǒng)掃描組織芯片并用Aperio Image Scope version軟件（美國）讀片。CD66b蛋白存在于腫瘤細(xì)胞間質(zhì)，出現(xiàn)黃褐色或棕色顆粒為陽性。選擇5個(gè)染色均勻的區(qū)域，在0.05 mm2的面積內(nèi)計(jì)算CD66b中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目，取其平均值視為該組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤個(gè)數(shù)。免疫組織化學(xué)評(píng)分由4位研究者（2名病理專家和2名臨床醫(yī)師）采用盲法閱片判定，評(píng)分有較大分歧時(shí)經(jīng)協(xié)商解決。取4例計(jì)數(shù)的平均值作為該樣本最終結(jié)果。將結(jié)果的中位數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，將126例胃癌患者分為高浸潤組和低浸潤組。

1.2.3 隨訪 患者首程治療結(jié)束后2年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次，3～5年內(nèi)每6個(gè)月復(fù)查1次。復(fù)查主要包括常規(guī)體格檢查、血常規(guī)、肝腎功能及影像學(xué)檢查。通過電話進(jìn)行隨訪。隨訪開始于患者出院，終止于患者死亡，隨訪截止時(shí)間為2015年6月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。外周血中NLR聯(lián)合胃癌組織中CD66b蛋白表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性，采用χ2檢驗(yàn)或Mann-Whitney U進(jìn)行檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存分析及Log-rank比較外周血中NLR聯(lián)合胃癌組織中CD66b中性粒細(xì)胞浸潤高低與預(yù)后的關(guān)系。多因素Cox回歸分析用于識(shí)別與胃癌預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD66b在胃癌組織中的表達(dá)

在126例胃癌組織樣本中，63例CD66b高表達(dá)，63例CD66b低表達(dá)，且均表達(dá)于胃癌組織間質(zhì)內(nèi)。胃癌組織CD66b高、低表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 CD66b在胃癌組織中的表達(dá)（IHC×200）

2.2 外周血中NLR聯(lián)合胃癌組織中TANs浸潤與臨床病理特征之間的關(guān)系

將外周血中NLR高低與胃癌組織中TANs浸潤高低聯(lián)合后，共分為4個(gè)組，分別為NLR高合并TANs高浸潤組、NLR高合并TANs低浸潤組、NLR低合并TANs高浸潤組和NLR低合并TANs低浸潤組。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤患者與年齡、性別、TNM分期、輔助放化療、血清CEA水平不相關(guān)。外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤患者與分化程度和腫瘤大小相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 胃癌患者外周血NLR聯(lián)合組織中CD66b蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 生存分析

生存分析及Log-rank分析結(jié)果顯示，外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤組生存率最低，外周血低NLR聯(lián)合胃癌組織TANs高浸潤組生存率最高，而外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs高浸潤組與外周血低NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.4 單因素及多因素Cox回歸分析

患者總生存期的單因素Cox回歸分析顯示，外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.008），腫瘤個(gè)體較大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、輔助放化療（P=0.005）、血清CA199水平高（P=0.012）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；將單因素回歸分析有意義的變量進(jìn)一步納入Cox多因素回歸分析顯示，外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.042），腫瘤個(gè)體大（P=0.048）、高TNM分期（P=0.005）、輔助放化療（P=0.026）、血清CA199水平（P=0.015）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）?；颊邿o病生存期的單因素Cox回歸分析顯示，外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.008），腫瘤較大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、輔助放化療（P=0.005）、血清CA199水平較高（P=0.014）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；進(jìn)一步納入多因素回歸分析顯示，外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.046），高TNM分期（P=0.005）、放化療（P=0.028）、血清CEA199水平較高（P=0.024）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3）。

圖2 胃癌患者血液NLR聯(lián)合組織中CD66b表達(dá)的生存分析

表2 胃癌患者總生存期的單因素及多因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者無病生存期的單因素及多因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者無病生存期的單因素及多因素Cox回歸分析（續(xù)表3）

3 討論

外周血及組織中的中性粒細(xì)胞具有相同的來源。中性粒細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，在骨髓干細(xì)胞分化發(fā)育后，進(jìn)入血液或組織中。當(dāng)局部組織發(fā)生感染時(shí)，中性粒細(xì)胞能夠滲出血管，通過趨化運(yùn)動(dòng)等機(jī)制到達(dá)感染部位，發(fā)揮機(jī)體免疫防御功能。然而，隨著研究的進(jìn)展，除了發(fā)揮抗感染作用，組織中的TANs與胃癌的發(fā)生、發(fā)展也存在密切關(guān)系［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，TANs受到來源于腫瘤微環(huán)境的不同信號(hào)影響可分化為N1、N2型，N1型主要通過殺傷病原體，產(chǎn)生免疫反應(yīng)等抑制腫瘤的進(jìn)展，N2型主要通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲，細(xì)胞外基質(zhì)的重建，血管、淋巴管的形成等而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［10］。由此可見，血液和組織中的中性粒細(xì)胞之間可能存在著某種聯(lián)系，共同促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。目前，尚缺乏區(qū)分N1、N2型中性粒細(xì)胞較好的標(biāo)志物，而CD66b作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用。因此，本研究檢測(cè)血液中NLR和胃癌組織中總的中性粒細(xì)胞的浸潤情況，研究其聯(lián)合作用對(duì)胃癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

目前，雖缺乏外周血中NLR聯(lián)合胃癌組織中的中性粒細(xì)胞浸潤與胃癌預(yù)后的研究，但關(guān)于外周血NLR與胃癌預(yù)后關(guān)系的研究較多。Jin等［11］對(duì)1 220例非手術(shù)治療的晚期胃癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，NLR升高是患者總生存期縮短的獨(dú)立預(yù)后因素。Aliustaoglu等［12］發(fā)現(xiàn)術(shù)前NLR是行根治性切除并在術(shù)后實(shí)施輔助化療的胃癌患者總生存期和無病生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Hottenrott等［13］指出NLR升高是相對(duì)早期胃癌病例的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，外周血NLR高聯(lián)合組織中性粒細(xì)胞低浸潤提示胃癌患者預(yù)后較差，與上述研究結(jié)果一致。關(guān)于胃癌組織中TANs與胃癌預(yù)后相關(guān)性的研究結(jié)果說法不一。有研究顯示，胃癌組織中TANs高浸潤提示預(yù)后較好［5］。Zhao等［14］研究表明，胃癌組織中TANs高浸潤提示預(yù)后較差。出現(xiàn)此差異的可能原因?yàn)榍罢卟捎肅D66b標(biāo)記中性粒細(xì)胞，后者采用CD15標(biāo)記中性粒細(xì)胞。CD15不僅可以表達(dá)于中性粒細(xì)胞，也可表達(dá)于單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，可能造成了對(duì)預(yù)后估計(jì)的偏差［15］。CD66b是高度糖基化的CEA家族蛋白，由CGM6基因編碼，表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。使用高通量篩選流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD66b識(shí)別中性粒細(xì)胞的純度為99%［16］，且CD66b已被廣泛應(yīng)用于腎細(xì)胞癌，肝癌和胃癌等腫瘤以識(shí)別嗜中性粒細(xì)胞［17-18］。本研究結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞高浸潤胃癌患者預(yù)后較好，與既往研究結(jié)果一致，具有一定的可靠性。

血液和組織中的中性粒細(xì)胞均可影響胃癌患者的預(yù)后。外周血NLR升高引起胃癌患者預(yù)后較差的原因可能為：1）中性粒細(xì)胞升高可引起生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等一系列促腫瘤血管形成的物質(zhì)增加，從而促進(jìn)腫瘤的生長和增殖［19-20］；2）NLR的升高提示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)或絕對(duì)減少，從而降低機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答［21］。而組織中N2型TANs可以通過產(chǎn)生活性氧、生成基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長因子等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)重建，血管、淋巴管的形成等。另外，N1型TANs可通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，與腫瘤細(xì)胞直接作用等發(fā)揮抗腫瘤作用，也可招募CD8+T淋巴細(xì)胞抑制腫瘤的進(jìn)展。目前，關(guān)于血液和腫瘤組織中中性粒細(xì)胞相互作用的研究較少。本研究結(jié)果表明，外周血NLR高聯(lián)合組織TANs低浸潤提示胃癌患者預(yù)后較差，推測(cè)血液中的中性粒細(xì)胞滲透血管到達(dá)組織后，可能仍然與血液中的中性粒細(xì)胞存在相互作用。因此，未來亟需深入探究血液及胃癌組織中的中性粒細(xì)胞相互作用方式與促瘤或抑瘤作用及其機(jī)制，不僅可引導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，也可為尋找胃癌治療新靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

尋找一種精確的評(píng)價(jià)腫瘤患者預(yù)后的方法是一直以來研究的熱點(diǎn)。TNM分期是目前評(píng)估胃癌患者預(yù)后的主要方法。但判斷預(yù)后不能僅靠單一指標(biāo)，既要考慮到腫瘤相關(guān)的因素（如TNM分期）還應(yīng)考慮到患者本身的免疫狀態(tài)，以及腫瘤與機(jī)體的免疫炎癥、反應(yīng)介質(zhì)等。通過多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：外周血高NLR聯(lián)合胃癌組織中TANs低浸潤、腫瘤體積大、高TNM分期、輔助放化療、血清CA199水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，以上述指標(biāo)建立一個(gè)綜合的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)更能準(zhǔn)確地評(píng)估患者的預(yù)后，但需要更有力的證據(jù)支持。

綜上所述，術(shù)前外周血NLR聯(lián)合胃癌組織中TANs浸潤可作為判斷胃癌患者術(shù)后預(yù)后的指標(biāo)，且術(shù)前外周血NLR高聯(lián)合胃癌組織中TANs低浸潤胃癌患者的預(yù)后較差。外周血NLR高聯(lián)合胃癌組織TANs低浸潤有望成為預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的新的生物標(biāo)志物，且兩者聯(lián)合可提高對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。本研究不足之處在于樣本量偏小及回顧性研究，對(duì)于胃癌患者外周血液NLR聯(lián)合胃癌組織中TANs浸潤與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

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