徐曉燕 閻昭 王雨萌 孟昭婷 陳金良 王青山 林麗 蘇雨棟 丁少峰 朱琳 陳鵬

肺癌是我國及世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%。以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKIs）為代表的靶向藥物是晚期NSCLC的重要治療方式，EGFR突變是EGFR-TKIs治療的重要靶點和關(guān)鍵性預測標志物。肺癌晚期患者居多，手術(shù)機會少，突變的組織受檢率低。血液中循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）可以反映腫瘤原發(fā)部位的基因改變［2-4］，利用cfDNA進行EGFR突變檢測具有簡便、快捷、微創(chuàng)等獨特優(yōu)勢，加之cfDNA半衰期短［5］，實時反映腫瘤的突變狀態(tài)，使動態(tài)監(jiān)測成為可能。目前對于cfDNA的研究以及指導臨床的數(shù)據(jù)并不多，cfDNA的檢測方法尚缺乏統(tǒng)一標準。焦磷酸化激活聚合反應(yīng)（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）是一種原創(chuàng)性核酸擴增技術(shù)，通過封閉性引物定向串聯(lián)焦磷酸化反應(yīng)和聚合反應(yīng)而具有超高靈敏度和特異度［6］。本研究主要探討PAP動態(tài)監(jiān)測血漿cfDNA在進展期非小細胞肺癌患者治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016年3月至2017年6月天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院就診的進展期NSCLC患者85例，其中男性47例（55.3%），女性38例（44.7%），年齡32～80歲，中位年齡62歲。ⅢA期4例（4.7%），ⅢB期4例（4.7%），Ⅳ期77例（90.6%）。腺癌78例（91.8%），腺鱗癌3例（3.4%），大細胞癌2例（2.4%），肉瘤樣癌2例（2.4%）。NSCLC診斷標準依據(jù)衛(wèi)生部《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》。對85例患者，進行血漿cfDNA EGFR突變檢測，對突變陽性的38例患者進行連續(xù)血漿檢測（每2個月1次）。本研究通過天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，所有受試者入組前均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本 常規(guī)方法靜脈采集10 mL全血樣本，于2 h內(nèi)使用人血漿游離核酸提取試劑盒（天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司）分離提取cfDNA，使用基于PAP核酸擴增實時熒光PCR法的EGFR基因突變檢測試劑盒（天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司）對EGFR的特定變異類型19Del、L858R和T790M進行檢測。首次檢測同時使用首個獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準用于血液EGFR特定突變檢測的基于擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplication refractory mutation system，ARMS）實時熒光PCR法的EGFR基因突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）對比驗證。血漿樣本采集、運送、保存、檢測標準依據(jù)CFDA制定的《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》及試劑盒說明書要求。

1.2.2 收集與隨訪 患者臨床病理特征及組織基因突變信息均來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病歷與檢測報告，組織EGFR突變檢測方法為傳統(tǒng)Sanger測序法。采用面訪、電話及病歷查閱方式對患者進行隨訪，患者療效評價標準依據(jù)RECIST 1.1版。隨訪截至2017年7月30日，隨訪時間4～12個月，中位隨訪時間為8個月，隨訪率100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。血漿與組織樣本基因突變檢測結(jié)果及兩種檢測方法對血漿基因突變檢測結(jié)果的差異性分析采用McNemar檢驗，組間率的比較及臨床病理特征的分析采用χ2檢驗，在樣本數(shù)量過少時使用Fisher test檢驗，檢驗水準a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿與組織EGFR突變檢測結(jié)果比較

對其中已有組織檢測結(jié)果的42例進行血漿與組織EGFR突變狀況比較，一致性69.0%（29/42），靈敏度47.4%（9/19），特異度87.0%（20/23），陽性預測值75.0%（9/12），陰性預測值66.7%（20/30）；McNemar檢驗認為兩樣本檢測結(jié)果一致（P=0.092）。血漿與組織EGFR突變狀況比較見表1。

表1 血漿與組織EGFR突變狀況比較 （n=42）

2.2 PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變狀況比較

對85例PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變結(jié)果比較，一致性81.2%（69/85），靈敏度56%（14/25），特異度91.7%（55/60），陽性預測值73.7%（14/19），陰性預測值83.3%（55/66）；McNemar檢驗認為兩種方法檢測結(jié)果一致（P=0.210）。PAP與ARMS PCR檢測血漿EGFR突變狀況的一致性見表2。

表2 PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變狀況的一致性（n=85）

2.3 血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系

85例患者中EGFR突變狀況，與年齡、吸煙情況、腫瘤家族史、體力狀態(tài)評分、病理類型及疾病分期無顯著相關(guān)性，僅與性別相關(guān)。血漿EGFR突變發(fā)生率女性較男性高［65.0%（13/20）vs.75.0%（7/20），P＜0.05］，差異具有統(tǒng)計學意義。血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系見表3。

2.4 血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與臨床診治的關(guān)系

對組織或血漿EGFR突變陽性的38例患者進行每2個月1次外周血基因突變動態(tài)檢測，共得到113份不同時期血漿樣本，同前次血漿EGFR突變狀況比較，動態(tài)監(jiān)測結(jié)果為突變型（突變型→突變型，野生型→突變型）或野生型（突變型→野生型，野生型→野生型）；收集相應(yīng)時間范圍臨床資料進行統(tǒng)計學分析，突變變化情況與患者TNM分期（P=0.179）、治療方法（P=0.885）無關(guān)；與疾病進展情況（P＜0.001）有關(guān)。疾病進展時血漿檢測結(jié)果突變型62.5%（15/24），疾病穩(wěn)定或緩解時血漿檢測結(jié)果突變型21.3%（19/89），差異具有統(tǒng)計學意義。血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與臨床診治的關(guān)系見表4。

表3 血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系 （n=85）

表4 血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與診治的關(guān)系

3 討論

cfDNA是血液中被降解的DNA片段，其中來源于腫瘤細胞的被稱作循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。cfDNA反映原發(fā)或轉(zhuǎn)移部位腫瘤的基因變化情況，被認為可代替組織標本進行突變檢測。在EGFR基因突變檢測中，如果組織標本不足或難以獲得，血液是合適的替代生物材料［7］。簡便、快捷、微創(chuàng)的非侵入性獲得方式，以及在術(shù)后患者、晚期患者、EGFR-TKIs治療患者的基因檢測方面克服的術(shù)后再活檢組織不足、腫瘤異質(zhì)性、重復多次等問題，使血液檢測表現(xiàn)出組織檢測不可比擬的優(yōu)勢。

目前尚缺乏cfDNA標本采集處理和分析檢測的統(tǒng)一標準。普遍認為需使用EDTA抗凝管采血，保證采血到實驗室處理間隔時間在4 h以內(nèi)，血漿檢測優(yōu)于血清［8］。Wang等［9］認為ctDNA的釋放可能存在時間特異性，但同一天不同時間點采血對基因檢測結(jié)果沒有影響。本研究采用EDTA抗凝管，受試者清晨采血，血液采集到實驗室處理間隔時間在2 h以內(nèi)。分離血漿標本提取cfDNA，采用PAP檢測突變。焦磷酸化反應(yīng)是脫氧核糖核酸聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)，3'末端阻斷性引物（封閉性引物）因帶有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻斷劑）不能被直接延伸，在焦磷酸化反應(yīng)去除阻斷劑后被聚合酶延伸，PAP定向串連焦磷酸化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，具有很高的靈敏度和特異度，能從摻雜的十億個幾乎完全相同的核酸分子中特異地擴增出一個拷貝的核酸分子，這種水平的選擇性比現(xiàn)有的PCR技術(shù)高出一百萬倍以上［6］。

PAP對血漿cfDNA的檢測結(jié)果，與組織檢測結(jié)果及ARMS-PCR血漿檢測結(jié)果比較均無顯著性差異，提示PAP可以用于檢測血漿cfDNA突變。血漿與組織EGFR突變檢測結(jié)果存在一致性［10-11］，Reck等［12］的血漿和組織EGFR突變檢測，一致性為89%，敏感度46%，特異度97%，陽性預測值78%，陰性預測值90%。本研究數(shù)據(jù)較之偏低，42例中存在13例血漿和組織檢測結(jié)果不符，可能與采樣間隔時間較長而受到腫瘤異質(zhì)性影響有關(guān)，13例患者組織檢測標本均為確診時手術(shù)標本或活檢組織，血漿樣本采集時間則在化療1個周期后或服用EGFR-TKIs后。腫瘤存在轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶之間的空間特異性，不同階段不同疾病狀態(tài)的時間特異性，cfDNA的動態(tài)檢測被認為可以克服異質(zhì)性難題，實現(xiàn)實時監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)獲得性耐藥等［13］。PAP與ARMS-PCR均可被應(yīng)用于cfDNA的動態(tài)檢測，但PAP采用特殊封閉性引物產(chǎn)生的靈敏度和特異性較ARMS-PCR更高，且價格更為低廉，對于需要進行多次血漿檢測的患者可能更為適用。

目前普遍認為EGFR突變的優(yōu)勢人群是亞裔、年輕、女性、不吸煙、腺癌患者［14］。本研究檢測血漿EGFR突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)突變發(fā)生率僅與性別相關(guān)。差異可能源于檢測標本的不同，即組織與血漿突變的優(yōu)勢人群可能有所差異。Wang等［15］研究發(fā)現(xiàn)對于二線或多線使用靶向治療者，實時血漿檢測突變陽性，不考慮組織檢測結(jié)果（B+/T-和B+/T+）者，較血漿檢測陰性者（B-/T+）PFS長（P=0.044）。提示二線或多線接受靶向治療者，血檢具有重要價值，尤其是對于組織EGFR突變的非優(yōu)勢人群。

對于38例患者cfDNA動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，突變變化情況與患者TNM分期及治療方法無關(guān)，與疾病進展情況有關(guān)。cfDNA主要來自腫瘤細胞的壞死和凋亡，分期越晚、腫瘤內(nèi)EGFR突變負荷越大，cfDNA含量越多，血漿基因檢測越容易得到陽性結(jié)果；但研究也證實腫瘤內(nèi)EGFR突變負荷越大，患者對EGFR-TKIs治療效果越好［16］。本研究發(fā)現(xiàn)治療效果較好即疾病穩(wěn)定時，血漿突變檢出率較低，認為治療前血檢突變情況可能會與疾病分期相關(guān)，但治療過程中實時血漿檢測突變情況與分期無關(guān)。

研究結(jié)果顯示血漿基因突變變化情況與治療手段本身無顯著相關(guān)性，而與療效相關(guān)。觀察到9例血漿突變陽性的患者在接受化療后突變消失，這基于疾病緩解或穩(wěn)定，因為疾病進展時突變又再次出現(xiàn)。Zhang等［17］也曾對治療前后患者血漿基因突變狀態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)突變情況不受化療影響（P＞0.05），但受靶向治療影響（P＜0.05）。Guo等［18］對早期患者手術(shù)前后cfDNA檢測對比發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后cfDNA水平較之前增高，但突變頻率降低，認為手術(shù)傷口導致了正常細胞過多釋放cfDNA，但突變頻率不受cfDNA總量的影響。本研究中治療方式為手術(shù)者為術(shù)后復發(fā)行血漿基因檢測，考慮存在疾病復發(fā)腫瘤負荷增加因素，未得到手術(shù)后突變檢出率低的結(jié)果。若突變狀況與治療方法無關(guān)，僅與疾病進展情況有關(guān)，則cfDNA實時監(jiān)測可廣泛用于突變患者的療效評價而不局限于接受靶向治療者。

疾病進展時較穩(wěn)定或緩解時血漿基因突變檢出率高，考慮與疾病進展腫瘤負荷增加及時間特異性有關(guān)。提示在動態(tài)監(jiān)測過程中，血漿檢測結(jié)果由陰性變?yōu)殛栃曰虺掷m(xù)陽性，疾病進展可能性大。血漿檢測結(jié)果陰性者考慮為治療有效，cfDNA水平低不易檢出。在疾病進展患者中，本研究不僅觀察到血漿檢測突變呈陽性，更有6例突變出現(xiàn)早于影像學評估，這又提示cfDNA的動態(tài)檢測不僅能夠幫助判斷療效，更能早期發(fā)現(xiàn)疾病進展。

本研究觀察到9例患者在EGFR-TKIs治療過程中血漿檢測出現(xiàn)T790M突變，其中1例接受化療6個周期，療效評價穩(wěn)定，血檢突變消失，6個月后疾病進展，血檢突變再次出現(xiàn)，接受奧希替尼治療后，疾病穩(wěn)定，血檢突變再次消失；另有6例出現(xiàn)T790M突變后隨即接受奧希替尼治療；疾病控制率71.4%（5/7）。1例接受化療，療效評價穩(wěn)定，動態(tài)血漿監(jiān)測仍在進行當中；1例暫繼續(xù)服用易瑞沙治療。Xu等［19］的研究中觀察到2例19Del突變患者在靶向治療2年后血漿檢測出現(xiàn)19Del和T790M雙突變，早于疾病惡化5個月。Jinfeng等［20］對120例服用EGFR-TKIs的患者進行了連續(xù)5次（每2個月1次）血漿突變檢測，49%的患者出現(xiàn)T790M突變并預后不良。Soria等［21］的研究則發(fā)現(xiàn)患者獲得性耐藥后，靶向藥物聯(lián)合化療相比于單純化療并不能延長患者生存期，而實時血漿T790M檢測對下一步治療具有重要的指導意義。

de Las Casas等［22］報道了1例動態(tài)監(jiān)測cfDNA突變的病例。組織檢測L858R突變患者，靶向治療16個月后cfDNA突變檢測結(jié)果為L858R及T790M突變，化療后療效評價為部分緩解，血漿檢測顯示L858R及T790M突變消失。半年后再一次血漿檢測呈L858R及T790M突變，隨后影像學證實疾病進展。提示cfDNA動態(tài)監(jiān)測能早期發(fā)現(xiàn)疾病進展、評價療效，基因突變水平升高提示疾病進展，治療有效時突變水平下降或突變消失，與本研究結(jié)果相符。

本研究樣本量較少，持續(xù)時間較短，血漿EGFR基因突變動態(tài)變化與臨床療效關(guān)系分析僅局限于近期療效方面；使用的檢測技術(shù)僅對cfDNA基因突變進行了定性分析，定量水平分析可能會對本研究結(jié)果補充支持，抑或有新的發(fā)現(xiàn)。

血漿cfDNA比例低、半衰期短，高度片段化，檢測cfDNA突變的方法必須具有高度靈敏性和特異性。封閉性引物的雙向選擇性在理論上決定了PAP擁有超高的靈敏度和特異度。這一方法檢測cfNDA與ARMS法檢測及組織檢測結(jié)果一致，表明PAP在cfNDA檢測中具有極大的臨床應(yīng)用前景。PAP動態(tài)監(jiān)測NSCLC血漿cfDNA突變狀況，能夠預測靶向治療的療效，對繼發(fā)的T790M突變具有診斷價值。而化療后敏感突變及耐藥T790M突變的消失則提示動態(tài)檢測對于化療亦有很好的預測療效價值。夏國豪等［23］研究發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs治療晚期NSCLC長期獲益后獲得性耐藥的患者，先化療、后再次應(yīng)用EGFR-TKIs，大部分患者仍能取得一定療效。對于這些需要化療以及靶向藥物交替治療的患者，cfDNA的動態(tài)監(jiān)測是一項有價值的療效評價手段，能夠幫助更精確的選擇治療方案。

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[2]Molina-Vila MA,Mayo-de-las-Casas C,Giménez-Capitán A,et al.A liquid biopsy in non-small cell lung cancer[J].Front Med,2016,23(3):69.

[3]Pérez-Ramírez C,Ca?adas-Garre M,Robles AI,et al.Liquid biopsy in early stage lung cancer[J].Transl Lung Cancer Res,2016,5(5):517-524.

[4]Sorber L,Zwaenepoel K,Deschoolmeester V,et al.Circulating cellfree nucleic acids and platelets as a liquid biopsy in the provision of personalized therapy for lung cancer patients[J].Lung Cancer,2017,107:100-107.

[5]Diehl F,Schmidt K,Choti MA,et al.Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J].Nat Med,2008,14(9):985-990.

[6]Liu Q,Sommer SS.PAP:detection of ultra rare mutations depends on P*oligonucleotides:"sleeping beauties"awakened by the kiss of pyrophosphorolysis[J].Hum Mutat,2004,23(5):426-436.

[7]《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制訂專家組.非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識[J].中華醫(yī)學雜志,2015,95(46):3721-3726.

[8]Normanno N,Denis MG,Thress KS,et al.Guide to detecting epidermal growth factor receptor(EGFR)mutations in ctDNA of patients with advanced non-small-cell lung cancer[J].Oncotarget,2017,8(7):12501-12516.

[9]Wang J,Bai H,Hong C,et al.Analyzing epidermal growth factor receptor mutation status changes in advanced non-small-cell lung cancer at different sampling time-points of blood within one day[J].Thorac Cancer,2017,8(4):312-319.

[10]Ma M,Shi C,Qian J,et al.Comparison of plasma and tissue samples in epidermal growth factor receptor mutation by ARMS in advanced non-small cell lung cancer[J].Gene,2016,591(1):58-64.

[11]Weber B,Meldgaard P,Hager H,et al.Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays[J].BMC Cancer,2014,14:294.

[12]Reck M,Hagiwara K,Han B,et al.ctDNA Determination of EGFR Mutation Status in European and Japanese Patients with Advanced NSCLC:The ASSESS Study[J].J Thorac Oncol,2016,11(10):1682-1689.

[13]Pérez-Callejo D,Romero A,Provencio M,et al.Liquid biopsy based biomarkers in non-small cell lung cancer for diagnosis and treatment monitoring[J].Transl Lung Cancer Res,2016,5(5):455-465.

[14]Shi Y,Au JS,Thongprasert S,et al.A prospective,molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology(PIONEER)[J].J Thorac Oncol,2014,9(2):154-162.

[15]Wang Y,Duan J,Chen H,et al.Analysis of EGFR mutation status in tissue and plasma for predicting response to EGFR-TKIs in advanced non-small-cell lung cancer[J].Oncology Letters,2017,13(4):2425-2431.

[16]Zhou Q,Zhang XC,Chen ZH,et al.Relative abundance of EGFR mutations predicts benefit from getfiinib treatment for advanced nonsmall-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2011,29(24):3316-3321.

[17]Zhang C,Wei B,Li P,et al.Prognostic value of plasma EGFR ctDNA in NSCLC patients treated with EGFR-TKIs[J].PLoS One,2017,12(3):e0173524.

[18]Guo,N,Lou F,Ma Y,et al.Circulating tumor DNA detection in lung cancer patients before and after surgery[J].Sci.Rep,2016,doi:10.1038/srep33519

[19]Xu T,Kang X,You X,et al.Cross-platform comparison of four leading technologies for detecting EGFR mutations in circulating tumor DNA from non-small cell lung carcinoma patient plasma[J].Theranostics,2017,7(6):1437-1446.

[20]Jinfeng He,Wei Tan,Jingping Ma,et al.Circulating tumor cells and DNA for real-time EGFR detection and monitoring of non-small-cell lung cancer[J].Future Oncol,2017,13(9):787-797.

[21]Soria JC,Wu YL,Nakagawa K,et al.Gefitinib plus chemotherapy versus placebo plus chemotherapy in EGFR-mutation-positive nonsmall-cell lung cancer after progression on first-line gefitinib(IMPRESS):a phase 3 randomised trial[J].Lancet Oncol,2015,16(8):990-998.

[22]de Las Casas CM,Gonzalez-Cao M.Usefulness of circulating free DNA for monitoring epidermal growth factor receptor mutations in advanced non-small cell lung cancer patients:a case report[J].Transl Lung Cancer Res,2016,5(5):532-537.

[23]夏國豪,曾赟,方瑛,等.化療后再使用EGFR-TKI治療晚期非小細胞肺癌的臨床研究[J].中國腫瘤臨床,2014,41(22):1454-1458.