李苑，王麗平，余海霞，楊水兵，胡亞芹，*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058；2.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

三疣梭子蟹是一種肉質(zhì)細(xì)嫩的甲殼類生物[1]，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，是一種被人們廣泛喜愛的水產(chǎn)品[2]。然而由于其肌肉結(jié)構(gòu)組織松散，梭子蟹死后發(fā)生復(fù)雜的物理、化學(xué)及生化變化，體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪等被內(nèi)源和外源的酶或微生物分解成小分子的產(chǎn)物，并且被腐敗微生物利用，在質(zhì)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)上都發(fā)生巨大的變化，并產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)等，影響其風(fēng)味及食用價(jià)值[3-4]。因此，選擇合適的方法對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行保藏，延長(zhǎng)其貨架期，具有重要的意義。

目前水產(chǎn)品的保鮮技術(shù)主要有低溫保鮮技術(shù)[5-6]、生化保鮮技術(shù)[7-8]、高壓保鮮技術(shù)[9-10]、氣調(diào)保鮮技術(shù)等[11]。隨著科技的發(fā)展和人們對(duì)于水產(chǎn)品品質(zhì)要求的提高，新的保鮮方法例如冰溫保鮮[12]、輻照保鮮[13]、臭氧保鮮[14]、微凍保鮮等也被研究和逐步應(yīng)用。

微凍保鮮是將貯藏溫度控制在低于被凍結(jié)生物體冰點(diǎn)1℃～2℃的一種保鮮技術(shù)，與傳統(tǒng)的冷藏技術(shù)相比，微凍保鮮使得微生物的生長(zhǎng)得到更好的抑制，從而起到延長(zhǎng)貨架期的作用[15]；與傳統(tǒng)的冷凍技術(shù)相比，微凍過(guò)程中水產(chǎn)品部分結(jié)冰，通過(guò)抑制冰晶的生成，控制了冰晶對(duì)肌肉組織的損害，控制水分的流失[16]。但是微凍對(duì)于環(huán)境溫度的要求較高，很小的溫度波動(dòng)都會(huì)使得肌肉中的冰晶大量生長(zhǎng)[17]。

冰晶的形成分為晶核形成和晶體生長(zhǎng)兩步。在水分凍結(jié)的過(guò)程中，電場(chǎng)對(duì)水分子施加力矩，破壞其平衡狀態(tài)，從而使得晶核的形成受到抑制[18]。同時(shí)，電場(chǎng)的引入可以造成水與酶結(jié)合狀態(tài)的變化，使得酶失活[19]。電場(chǎng)同時(shí)具有一定的殺菌作用，電穿孔模型是其中廣為接受的理論。電場(chǎng)也可以通過(guò)增大細(xì)胞的跨膜電位，使得細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)流出而造成細(xì)胞的死亡[20]。

目前對(duì)于電場(chǎng)保鮮已經(jīng)有一些研究。Ko等[21]對(duì)羅非魚在高壓靜電場(chǎng)中進(jìn)行處理，殺菌效果比較明顯。Ko等[22]研究也發(fā)現(xiàn)高壓靜電場(chǎng)可以有效的抑制羅非魚的鹽溶性蛋白含量下降。陳建榮等[23]研究發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)處理的魚貯藏期得到了延長(zhǎng)。然而在微凍過(guò)程中引入電場(chǎng)的研究還很少。在微凍過(guò)程中加入電場(chǎng)，可以起到抑制冰晶生成的作用，在一定程度上減少微凍過(guò)程中冰晶對(duì)水產(chǎn)品造成的損傷。本研究采用三疣梭子蟹為原料，將其分別進(jìn)行有電場(chǎng)參與和無(wú)電場(chǎng)參與的微凍保鮮，通過(guò)對(duì)其貯藏過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，包括與蛋白相關(guān)的揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、SDS-PAGE電泳，與脂肪氧化相關(guān)的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、與微生物生長(zhǎng)相關(guān)的菌落總數(shù)（total viable count，TVC）以及微觀組織成分觀察，比較有無(wú)電場(chǎng)參與對(duì)于微凍過(guò)程的影響，為電場(chǎng)與微凍結(jié)合對(duì)水產(chǎn)品的保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮舟山三疣梭子蟹：浙江省舟山市國(guó)際水產(chǎn)城，選取重量約100.0 g～150.0 g的新鮮三疣梭子蟹，放入裝有碎冰的泡沫盒中40 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

三 氯 乙 酸 、 氧 化 鎂 、CuSO4、NaOH、HCl、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、2-硫代巴比妥酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。三羥甲基氨基甲烷、四乙基乙二胺、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L93-2L溫度記錄儀：杭州路格科技有限公司；YD202A石蠟切片機(jī)、D-A智能型生物組織攤片機(jī)、YD-B智能型生物組織烤片機(jī)：浙江省金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；DKS-12電熱恒溫水浴鍋：嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亨科學(xué)儀器廠；FLY-YS-108L恒溫保存箱：北京福意電器有限公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)有限公司；XBLL-23A絞肉機(jī)：上海帥佳電子科技有限公司；AR124CN分析天平：美國(guó) Ohaus公司；Tanon EPS 300垂直電泳儀：上海天能科技有限公司。

1.3 樣品處理

將活的三疣梭子蟹流水清洗5 min后，瀝干水分用自封袋包裝，分別置于-3℃普通微凍冰箱（P組）和-3℃電場(chǎng)微凍冰箱（D組）進(jìn)行保鮮。

電場(chǎng)微凍冰箱內(nèi)部左右兩側(cè)置有電場(chǎng)，其發(fā)射電源為220 V，經(jīng)變頻器輸出為3 000 V。

1.4 凍結(jié)曲線的測(cè)定

將溫度記儀設(shè)置為30 s記錄一次溫度后，將溫度探頭插入三疣梭子蟹腹部肌肉中，將三疣梭子蟹放入-18℃冰箱中，溫度隨時(shí)間變化的曲線即為凍結(jié)曲線。試驗(yàn)測(cè)定3次。根據(jù)凍結(jié)曲線得到三疣梭子蟹的凍結(jié)點(diǎn)，并確定其微凍溫度。

1.5 TVB-N的測(cè)定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中半微量定氮法進(jìn)行TVB-N的測(cè)定。

1.6 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取按照Lefever等[24]的方法來(lái)進(jìn)行。取約20 g樣品，加入10倍體積的緩沖液A（100 mmol/L NaCl-1 mmol/L EDTA-20 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0），勻漿30min后在4℃下1000g（3000r/min）離心15 min。向離心所得的沉淀中加入5倍體積的緩沖液A，按上述條件再次離心。棄去上清液后，向沉淀中加入5倍體積的緩沖液A進(jìn)行過(guò)濾，然后將沉淀用5倍體積的緩沖液A進(jìn)行沖洗，得到的濾液再在相同條件下進(jìn)行離心，得到沉淀。該過(guò)濾離心的過(guò)程重復(fù)2遍～3遍，最后得到的沉淀用5倍體積的緩沖液B（1 mol/L NaCl-50 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0）溶解，勻漿離心后的上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

1.7 SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳過(guò)程按照劉文娟[25]的方法進(jìn)行并稍加改動(dòng)。將按照1.6提取的5 mL肌原纖維蛋白溶液樣品和5 mL雙縮脲試劑混合后，在25℃下水浴1.5 h。用可見光紫外分光光度計(jì)于540 nm處測(cè)定吸光值，與牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線對(duì)照得到蛋白濃度，并用緩沖液B調(diào)整濃度至4 mg/mL。按樣品∶蛋白上樣緩沖液為1∶4（體積比）的比例處理樣品，樣品在95℃加熱5 min后冷卻，然后上樣10 μL。電泳分離膠為12%，濃縮膠為5%。恒壓100 V下進(jìn)行電泳。染色使用考馬斯亮藍(lán)溶液進(jìn)行。脫色后觀察蛋白條帶的變化。

1.8 TBA的測(cè)定

TBA的測(cè)定參照Siu等[26]的方法進(jìn)行并稍加改動(dòng)。將5.0 g樣品攪碎后，加入25 mL含有0.1%的EDTA溶液，振搖30 min后，混合物用雙層濾紙過(guò)濾，取5 mL上清液加入0.02mol/L的TBA溶液5mL，沸水浴40min后流水冷卻，5 000 r/min離心20 min，取上清液加入5 mL氯仿?lián)u勻，靜置后取上清液，分別在532 nm和600 nm處測(cè)定吸光值，按以下公式計(jì)算TBA值：

TBA/（mg/100 g）=（A532-A600）/155×（1/10）×（1/10）×72.6×100

1.9 TVC的測(cè)定

TVC的測(cè)定參照Wu等[27]的方法進(jìn)行，并加以改動(dòng)。向無(wú)菌袋中加入10.0 g樣品和90 mL0.9%的無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)5 min后，使用無(wú)菌生理鹽水對(duì)懸浮液進(jìn)行體積比為1∶10的連續(xù)稀釋。再分別吸取1 mL不同濃度稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)（每個(gè)稀釋濃度兩個(gè)平行，兩個(gè)空白），將冷卻至46℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，混合均勻，在瓊脂冷卻至凝固后，將接種好的平板在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)方法采用平板計(jì)數(shù)法。試驗(yàn)結(jié)果以lg（CFU/g）表示。

1.10 肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

參照胡玥等[28]的方法，三疣梭子蟹從腹部肌肉取樣，大小為5 mm×5 mm×10 mm，進(jìn)行垂直于肌原纖維方向的橫切，肌肉的微觀組織結(jié)構(gòu)在400×的光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值及方差表示。使用Excel 2007、SPSS 16.0軟件以及方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹凍結(jié)曲線分析及微凍溫度的確定

三疣梭子蟹的凍結(jié)曲線如圖1所示。

圖1 三疣梭子蟹凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curve of Pseudosciaena polyactis

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，三疣梭子蟹的中心溫度首先迅速降低，在第24 min左右到達(dá)第一個(gè)拐點(diǎn)，溫度為-2.6℃。凍結(jié)曲線中出現(xiàn)的第一個(gè)拐點(diǎn)為物料的凍結(jié)點(diǎn)。到達(dá)第一個(gè)拐點(diǎn)之后，隨著凍結(jié)過(guò)程的繼續(xù)進(jìn)行，三疣梭子蟹的溫度沒(méi)有顯著下降，即通過(guò)最大冰晶生成帶。在該過(guò)程中，肌肉中大部分水分形成冰晶。在通過(guò)最大冰晶生成帶后，繼續(xù)凍結(jié)，三疣梭子蟹溫度繼續(xù)下降，直到達(dá)到環(huán)境溫度（-18℃）并保持穩(wěn)定。根據(jù)微凍溫度在凍結(jié)點(diǎn)1℃～2℃的定義，綜合考慮儀器實(shí)際情況及三疣梭子蟹的凍結(jié)點(diǎn)，選擇-4℃對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行貯藏。

2.2 兩種條件貯藏過(guò)程中三疣梭子蟹TVB-N變化

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是水產(chǎn)品體內(nèi)由于酶和微生物的作用而使蛋白質(zhì)等分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)的總稱，一般用于反映水產(chǎn)品的新鮮程度[29]。普通微凍和電場(chǎng)微凍貯藏過(guò)程中三疣梭子蟹的TVB-N值的變化如圖2所示。

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的TVB-N值都呈現(xiàn)了上升的趨勢(shì)，代表著三疣梭子蟹在貯藏過(guò)程中品質(zhì)的下降。電場(chǎng)微凍組表現(xiàn)出比普通微凍組緩慢的上升趨勢(shì)，這與Ko等[21]的研究結(jié)果一致。在貯藏第25天時(shí)，普通微凍組（P）和電場(chǎng)微凍組（D）的TVB-N值分別為26.1 mg/100 g和22.3 mg/100 g，根據(jù)GB 2733-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》的要求，海蟹中的TVB-N值應(yīng)≤25 mg/100 g，普通微凍組在貯藏第25天已超過(guò)海蟹TVB-N值應(yīng)≤25 mg/100 g的標(biāo)準(zhǔn)，為不可食狀態(tài)。在貯藏第31天，電場(chǎng)微凍組的TVB-N值達(dá)到25.2 mg/100 g，達(dá)到不可食用狀態(tài)。電場(chǎng)的添加可能通過(guò)抑制酶和微生物的活力達(dá)到了減緩三疣梭子蟹腐敗，從而達(dá)到延緩體內(nèi)揮發(fā)性鹽基氮增加的作用[30]。

圖2 普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹TVB-N變化Fig.2 Changes of TVB-N in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

2.3 兩種條件貯藏過(guò)程中三疣梭子蟹SDS-PAGE電泳分析

普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下，貯藏第7、16、28天時(shí)三疣梭子蟹的肌原纖維SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示。

圖3 普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹肌原纖維SDSPAGE電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

在圖3P組三疣梭子蟹的電泳圖譜中，肌球蛋白的條帶（130 k左右）隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸溶解，而250 k左右的蛋白條帶明顯加粗，這可能是由于肌原纖維中二硫鍵和二酪氨酸的形成導(dǎo)致的蛋白聚集[31]。與普通微凍組相比，電場(chǎng)微凍組250 k處的蛋白質(zhì)聚集顯示出了較慢的聚集，一方面，這可能與電場(chǎng)的殺菌作用導(dǎo)致三疣梭子蟹的腐敗進(jìn)程減緩，蛋白質(zhì)分解速度較普通微凍慢；另一方面，電場(chǎng)對(duì)冰晶的形成具有抑制作用，冰晶形成的減少減弱了冰晶對(duì)于組織細(xì)胞的擠壓，從而延緩了蛋白質(zhì)的變性。

2.4 兩種條件貯藏過(guò)程中三疣梭子蟹TBA變化

水產(chǎn)品中的脂肪，尤其是不飽和脂肪酸容易氧化變質(zhì)或者因受到微生物等的影響而腐敗，TBA值為判定脂肪氧化程度的一個(gè)指標(biāo)。普通微凍和電場(chǎng)微凍過(guò)程中三疣梭子蟹的TBA值變化如圖4所示。

圖4 普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹TBA變化Fig.4 Changes of TBA in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的TBA值都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。電場(chǎng)微凍組相對(duì)普通微凍組顯示出了較慢的TBA值增長(zhǎng)趨勢(shì)，在貯藏第35天，普通微凍組和電場(chǎng)微凍組TBA值分別達(dá)到了0.48 mg/100 g和0.58 mg/100 g。Ko等[21]認(rèn)為，這可能與電場(chǎng)的加入有關(guān)，電場(chǎng)會(huì)使得電荷在水產(chǎn)品表現(xiàn)形成，從而隔絕了氧氣的進(jìn)入，減緩了脂肪氧化的發(fā)生。另一方面，電場(chǎng)通過(guò)抑制冰晶形成，減緩了冰晶對(duì)細(xì)胞的破壞，減緩了水產(chǎn)品腐敗進(jìn)程，因此電場(chǎng)微凍組TBA值的增加減慢。

2.5 兩種條件貯藏過(guò)程中三疣梭子蟹TVC變化

菌落總數(shù)（TVC）是反映水產(chǎn)品新鮮程度的重要指標(biāo)。梭子蟹營(yíng)養(yǎng)豐富，水分含量高，外界微生物也容易侵染。圖5反映了普通微凍和電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹肌肉內(nèi)TVC的變化情況。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，普通微凍和電場(chǎng)微凍的菌落總數(shù)都是不斷增加，貯藏后期TVC的增加較前期快。電場(chǎng)微凍組菌落總數(shù)增加較普通微凍組慢。在貯藏第34天，電場(chǎng)微凍組和普通微凍組的TVC值分別達(dá)到6.40 lg（CFU/g）和7.53 lg（CFU/g）。這很可能是由于電場(chǎng)所具有的殺菌作用。

2.6 三疣梭子蟹肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

圖6表示了貯藏第10天和第31天時(shí)普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹微觀結(jié)構(gòu)的變化。

如圖6所示，在貯藏第10天，三疣梭子蟹肌肉細(xì)胞之間出現(xiàn)了比較小的縫隙，其中電場(chǎng)保鮮組的縫隙比較均勻，而普通微凍組存在一些不均勻的縫隙。隨著貯藏的進(jìn)行，電場(chǎng)微凍組（D）在第31天依然表現(xiàn)為較為均勻的肌肉組織間隙，而普通微凍組（P）則有明顯的冰晶聚集和肌肉纖維造成的粗細(xì)不一的空隙。這可能與電場(chǎng)抑制了冰晶的生長(zhǎng)有關(guān)。Kaale等[32]認(rèn)為，在有外部電場(chǎng)作用的情況下，由于平行于電場(chǎng)方向的水分子需要克服的位能低，容易克服固液界面阻力，完成從水到冰晶的轉(zhuǎn)變。因此除平行于電場(chǎng)方向的冰晶形成都受到抑制。

圖5 普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹TVC變化Fig.5 Changes of TVC in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

圖6 普通微凍及電場(chǎng)微凍條件下三疣梭子蟹肌肉微觀組織變化Fig.6 Changes of microstructure in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

3 結(jié)論

以三疣梭子蟹為對(duì)象，對(duì)比研究普通微凍和電場(chǎng)微凍兩種方法下其在貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)和肌肉微觀結(jié)構(gòu)的影響。電場(chǎng)微凍相對(duì)普通微凍，更好地維持了三疣梭子蟹在貯藏過(guò)程中的品質(zhì)，延緩了酶和微生物對(duì)肌肉的破壞，脂肪氧化速度減慢，肌肉微觀組織破壞程度也相對(duì)較低。電場(chǎng)微凍減緩了三疣梭子蟹的變質(zhì)，延長(zhǎng)了其貨架期。本研究將電場(chǎng)與微凍技術(shù)結(jié)合，為水產(chǎn)品保鮮提供了新的思路。

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