， ，，，

缺血后處理(ischemic postconditioning，IPOC)是在缺血預(yù)處理基礎(chǔ)上提出的新概念，具有重要的內(nèi)源性腦保護(hù)作用，可減輕腦缺血再灌注(ischmia/ reperfusion，I/R)損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酸肌醇-3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/Akt信號(hào)途徑參與IPOC的細(xì)胞保護(hù)，發(fā)揮抑制凋亡或促進(jìn)增殖等效應(yīng)[1]。藥物后處理是近年研究的另一個(gè)熱點(diǎn)，有研究證實(shí)其具有與IPOC類似作用[2]，但兩者是否具有協(xié)同作用尚待進(jìn)一步研究。臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，水蛭注射液治療急性腦梗死有確切療效[3]，但其后處理效應(yīng)及機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過觀察PI3K的表達(dá)變化，比較IPOC和聯(lián)合水蛭注射液后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響，以探討二者的協(xié)同腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物制備 健康雄性SD大鼠40只(SPF級(jí))，鼠齡2.0個(gè)月～2.2個(gè)月，體重250 g±50 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。水蛭注射液由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑室制備，選用廣西菲牛蛭的干燥全體經(jīng)水煎醇沉法提取，再經(jīng)跨熱處理法制得，每支含1 g原生藥(每支：2 mL)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將40只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注(MCAO)組、缺血后處理組(IPOC組)、缺血后處理+水蛭注射液后處理組(P-L組)。SO組：線栓只插入頸內(nèi)動(dòng)脈9 mm；MCAO組：實(shí)施90 min的腦缺血和24 h的再灌注；IPOC組與P-L組：在MCAO組基礎(chǔ)上，在再灌注即刻將線栓從頸總動(dòng)脈(CCA)內(nèi)抽出30 s后，再將線栓置入30 s，反復(fù)進(jìn)行3次后進(jìn)行再灌注24 h。并在再灌注同時(shí)給予P-L組水蛭注射液4 mg/kg腹腔注射，其余各組予4 mL生理鹽水腹腔注射。

1.3 造模方式 采用線栓法建立大鼠MCAO模型，之后參照文獻(xiàn)[4]行缺血后處理，即再灌注即刻將尼龍線栓從CCA內(nèi)抽出30 s，再將線栓重新置入30 s，反復(fù)3次后進(jìn)行再灌注24 h。

1.4 主要試劑 總RNA提取試劑盒購于中國(guó)TIANGEN公司；PCR反應(yīng)試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物及內(nèi)參均由大連寶生物有限公司提供；兔抗大鼠PI3K多克隆抗體購于美國(guó)Santa Cruz；偶聯(lián)有辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗購于武漢博士德生物有限公司；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購于上海康成生物公司。

1.5 大鼠腦梗死體積測(cè)定 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法。大鼠處死后取腦后經(jīng)視交叉水平向后行冠狀切片5片，厚度約2 mm，各腦片在同等條件下用數(shù)碼相機(jī)正反面拍照，應(yīng)用病理圖像分析儀測(cè)量每個(gè)腦片的梗死面積及該片總面積，按公式：[(各片正反面梗死面積之和/2)×片厚]/[(各片正反面總面積之和/2)×片厚]×100%計(jì)算梗死體積。

1.6 缺血半暗帶腦皮質(zhì)PI3K mRNA表達(dá)測(cè)定 ①大腦組織總RNA提?。簠⒖伎俁NA提取試劑盒說明書提??；②總RNA純度濃度測(cè)定：采用紫外分光光度法，測(cè)定每組RNA樣品260 nm～280 nm的吸光度，并根據(jù)OD260/OD280比值評(píng)估RNA的純度；③引物合成：PI3K，上游：GGCTGCTATGCCTGCTCTGTA；下游CATAGCCGGTGGCAGTCTTG產(chǎn)物長(zhǎng)度為154 bp；GAPDH上游5’-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3’；下游5’-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度133 bp；④比較兩基因擴(kuò)增效率：通過對(duì)照樣品、檢測(cè)樣品的目的基因及管家基因的Ct值，之后以管家基因Ct值為依據(jù)對(duì)目的基因進(jìn)行差值校正(ΔCT值)，以此表示其mRNA相對(duì)表達(dá)量；⑤反應(yīng)體系及條件：兩種基因同管擴(kuò)增，反應(yīng)體系均為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA模板2.0 μL、兩種基因上下游引物(10 pmol/ μL)各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)*3 0.4 μL，加無RNA酶的水6 μL。在Appllied Blosystem7500 Real PCR System中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60.2 ℃退火20 s，60.0 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。每例樣品及陰性對(duì)照均設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，取均值。

1.7 缺血半暗帶腦皮質(zhì)內(nèi)PI3K蛋白表達(dá)測(cè)定 取缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)組織，按比加入RIPA裂解液裂解，低溫離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，各樣本提取等量總蛋白(60 μL)，經(jīng)100 ℃ 5 min變性后，分別配制分離膠和濃縮膠，80 V電壓電泳2.5 h，300 mA濕轉(zhuǎn)2 h，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h，洗膜，之后加入一抗兔抗PI3K抗體(1∶1000)，37 ℃恒溫箱孵育2 h，4 ℃過夜孵育；次日洗膜，加入二抗偶聯(lián)有辣根過氧化物羊抗兔IgG室溫條件下孵育2 h，洗膜，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，經(jīng)顯影、定影后可見特異性條帶。采用Image-J圖像分析軟件測(cè)定PI3K和內(nèi)參GAPDH各顯色條帶的平均吸光度(A)值，以PI3K與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDH蛋白顯色條帶A的比值表示PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積比較 經(jīng)TTC染色后顯示，腦缺血再灌注后IPOC組較MCAO組腦梗死體積明顯減小，P-L組能進(jìn)一步縮小腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

組別梗死體積SO組 0.00±0.00MCAO組36.54±3.56IPOC組28.72±2.481)PL組22.21±2.052) 與MCAO組比較，1)P<0.05；與IPOC組比較，2)P<0.05。

2.2 各組大鼠PI3KmRNA表達(dá)比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，SO組PI3KmPNA表達(dá)量較少；與SO組比較MCAO組PI3KmPNA表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與MCAO組比較，IPOC組表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與IPOC組比較，P-L組PI3KmPNA表達(dá)量進(jìn)一步升高(P<0.05)。詳見表2。

組別PI3KCT值GAPDHCT值ΔCT值SO組28.36±0.9821.04±0.637.03±0.79 MCAO組26.56±0.9021.34±0.855.94±0.861)IPOC組25.61±0.9621.99±0.864.83±0.682)PL組24.03±0.8421.76±0.693.39±0.753) 與SO組比較，1)P<0.01；與MCAO組比較，2)P<0.05；與IPOC組比較，3)P<0.05。

2.3 PI3K蛋白表達(dá)的變化 Western blot顯示，SO組PI3K蛋白表達(dá)較少，與SO組比較，MCAO組PI3K蛋白表達(dá)量明顯增高(0.903±0.061 vs 1.156±0.065，P<0.01)；與MCAO組比較，IPOC組PI3K蛋白表達(dá)量明顯升高(1.381±0.083 vs 1.156±0.065，P<0.01)；與IPOC組比較，P-L組的表達(dá)量進(jìn)一步升高(1.449±0.176 vs 1.381±0.083，P<0.05)。詳見圖1。

圖1各組PI3K蛋白的表達(dá)

3 討 論

缺血后處理是指長(zhǎng)時(shí)間缺血后，于再灌注前短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)短暫的再灌注和停灌注，這可對(duì)后續(xù)的長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷產(chǎn)生保護(hù)。有研究表明，IPOC主要是通過激活細(xì)胞內(nèi)的再灌注損傷救援激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終抑制再灌注初期線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而使細(xì)胞獲得保護(hù)作用[5-6]。RISK是指對(duì)于器官的I/R損傷具有保護(hù)作用的一系列激酶，主要包括PI3K/Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)2條通路。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能抑制細(xì)胞的凋亡，從而起到保護(hù)腦組織的作用。PI3K下游有多種效應(yīng)分子，Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，后處理激活的Akt通過磷酸化激活其下游靶點(diǎn)，最后在線粒體水平，發(fā)揮抑制凋亡或促進(jìn)增殖等效應(yīng)，從而起到保護(hù)腦組織作用[7-8]。本課題前期研究證實(shí)IPOC后和水蛭注射液干預(yù)后能增加磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。因此提出假設(shè)，水蛭注射液可能通過PI3K/Akt信號(hào)途徑發(fā)揮腦保護(hù)功效。

藥物后處理是指在長(zhǎng)時(shí)間缺血后，于再灌注前或再灌注開始的幾分鐘內(nèi)用藥，通過藥物干預(yù)保護(hù)再灌注所導(dǎo)器官損傷[10]。與IPOC比較兩者作用機(jī)制相似，但藥物后處理更具臨床應(yīng)用價(jià)值，為治療器官再灌注損傷提供新策略。目前關(guān)于藥物后處理主要集中在心臟、腎臟等方面[11-12]，在腦缺血方面研究甚少藥物方面主局限在吸入麻醉藥物，如異氟烷和七氟烷等，通常稱為“麻醉藥物后處理”[13]。Ye等[14]研究發(fā)現(xiàn)七氟烷通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)線粒體上的GSK-3β磷酸化，減少凋亡，保護(hù)缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能。

中藥后處理具有療效顯著、副作用小、作用靶點(diǎn)多、價(jià)格便宜受到關(guān)注。水蛭是活血化瘀的良藥，具有破血逐瘀消瘤，可用于癥瘕痞塊，血癖經(jīng)閉，跌打損傷等。而中風(fēng)主要病機(jī)為氣血逆亂、瘀血阻絡(luò)，淤血貫穿中風(fēng)病的整個(gè)病理過程[15]。針對(duì)該病機(jī)，20世紀(jì)90年代我院在國(guó)內(nèi)率先研制出水蛭注射液，經(jīng)臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)腦缺血損傷療效確切[16-18]。但聯(lián)合水蛭注射液后處理尚未涉及神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域，是一個(gè)新的研究方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注24 h后，IPOC組較單純MCAO組的PI3KmRNA及其蛋白的表達(dá)較明顯升高，推測(cè)IPOC可能通過促進(jìn)PI3K表達(dá)相關(guān)而縮小腦梗死體積而起到腦保護(hù)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1]。P-L組的PI3KmRNA及其蛋白進(jìn)一步增加，提示水蛭注射液后處理與缺血后處理具有協(xié)同作用，為缺血性中風(fēng)的防治提供新思路和新方法，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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