廖 怡， 趙德蕊， 胡雪瑞， 吳家文

(1. 安徽中醫(yī)藥大學 研究生院,合肥 230012； 2. 安徽中醫(yī)藥大學 新安醫(yī)學教育部重點實驗室 科研實驗中心, 合肥 230038； 3. 安徽中醫(yī)藥大學 藥學院, 合肥 230012； 4. 安徽道地藥材品質提升協同創(chuàng)新中心, 合肥 230038； 5. 安徽中醫(yī)藥科學院, 合肥 230038)

當生物有機體受到環(huán)境中的應激原(一般為熱刺激)刺激后，可以產生高度保守的防御性蛋白質，從而產生對抗外界逆境因素的保護性反應，這些防御性蛋白質稱為熱應激蛋白(heat stress proteins, HSPs)，又名熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)。一般根據相對分子質量和同源程度將熱應激蛋白分為HSP100家族、HSP90(83～90 ku)家族、HSP70(66～79 ku)家族、HSP60家族以及小分子HSP(15～30 ku)家族[1-2]。其中研究最深入的是HSP90和HSP70家族，他們具有高度保守性，在機體正常情況下低量表達，當遇到外界不利因素的刺激后，可以大量表達。

熱應激蛋白是進化上高度保守、功能上至關重要和在生物體內與抗逆緊密相關的一類存在于整個生物界(從低等原核到高等動植物)的十分重要的蛋白質[3]。

對動物而言，高溫、低氧、創(chuàng)傷、重金屬離子等逆境因素可以誘導熱應激蛋白的產生，以維護細胞生存和內環(huán)境的穩(wěn)定。例如鮑恩東等[4]研究發(fā)現HSP70在急性熱應激損傷的肉雞心肌纖維胞漿內分布密集，說明HSP70的含量高低對心肌組織功能有影響且在心肌纖維內行使重要生理功能。Yu等[5]發(fā)現用2-去氧葡萄糖飼養(yǎng)的老鼠因缺血而引起缺氧時，HSP70的表達量會提高，從而減輕因低氧對機體的損傷，起到保護作用。Wang等[6]發(fā)現注射HSP47-反義脫氧核苷酸對手術創(chuàng)傷的新生鼠可有效抑制HSP47的表達及皮膚I型膠原的累積，且有效減輕創(chuàng)面愈合所需的膠原纖維紊亂。表明HSP47-反義脫氧核苷酸可能具有抑制皮膚瘢痕形成的治療潛力。沈驊等[7]發(fā)現鯽魚肝臟內HSP70的誘導表達受重金屬離子Cu2+、Zn2+濃度的影響顯著，表明HSP70可作為重金屬污染物生物標志物。

對植物而言，當外界環(huán)境溫度比正常生長溫度高10℃左右時，植物體內就會有熱應激蛋白的產生。植物熱應激蛋白對植物在逆境脅迫下引起的傷害具有很大的減緩作用，是植物短期適應逆境的必需組成成分，相關逆境因素如高溫、冷凍、干旱等均能誘發(fā)HSPs產生。陳忠等[8]發(fā)現高溫誘導豌豆幼苗中熱激蛋白Hpc60的產生對抗壞血酸過氧化物酶具有保護作用，表明高溫下植物產生的熱應激蛋白可以對機體重要的酶或蛋白質起保護作用從而使植物獲得耐熱性。近年的研究表明，在低溫刺激下，也能誘導HSPs的產生，例如HSPs和植物耐冷性的直接關系由Collins等[9]首先證實。雖然冷熱應激在植物體內屬于不同的反應過程，但這兩種逆境都可以誘導熱應激蛋白的表達。Coca等[10]研究發(fā)現向日葵受水分脅迫時小分子熱應激蛋白HSPl7.6和HSPl7.9基因高表達，且體內水分喪失程度與其mRNA表達水平呈正性相關。

以上研究均表明應激蛋白的產生與生物外界逆境密切相關，研究應激蛋白對探索降低逆境對動植物的傷害和研究動植物體內重要的抗逆機制有著非常重要的理論和實踐意義。

中藥苦參(SophoraflavescentsAit)是一種有著悠久歷史的豆科槐屬植物。具有清熱燥濕，殺蟲和利尿作用，在臨床上，它主要用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，外陰腫脹瘙癢，濕疹，外治滴蟲性陰道炎[11]。據報道，苦參具有多種藥理活性，如抗腫瘤[12]，抗菌，抗炎和鎮(zhèn)痛作用[13]。

本研究中，作者以苦參為研究對象首次克隆了苦參小分子量的應激蛋白hsp17.8的編碼序列，在大腸桿菌內實現了體外表達，并進一步對其理化性質、進化關系及結構特點等進行了分析。

1 材料

1.1 植物材料、菌株與載體

新鮮苦參組織取自安徽中醫(yī)藥大學藥物園，由楊青山老師鑒定；大腸桿菌E．coliDH5α、表達載體pET22b(+)由中國科學技術大學生命科學院施蘊渝教授惠贈；大腸桿菌E．coliBL21(DE3)、擴增載體pMD19-T Vector分別購自北京索萊寶科技有限公司、TaKaRa公司。

1.2 各種酶、試劑及試劑盒

rTaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶，DL2000 DNA Marker、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactoside, IPTG)，蛋白Marker均購自TaKaRa公司。RNA提取試劑盒[E.Z.N.A Plant RNA Kit (50)]為OMEGA產品、逆轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo公司、質粒小抽試劑盒[AxyPrepTMPlasmid miniprep Kit (50 prep)]和膠回收試劑盒[AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit (50 prep)]購自Axygen Scientific公司。

2 方法

2.1 苦參RNA的提取及cDNA的合成

從-80℃超低溫冰箱取新鮮苦參葉片在液氮中充分研磨成粉末，用RNA提取試劑盒提取苦參總RNA，將提取的總RNA取2 μL用DEPC水稀釋1000倍，在酶標儀(Microplate Reader)上測定260 nm、280 nm處的吸光度值(即光密度值OD), 計算剛剛提取的苦參總RNA濃度，并分析其純度；核酸電泳用來檢測苦參總RNA 的完整性。按照逆轉錄試劑盒的說明書將經檢測了的純度高完整性好的RNA用來合成cDNA。合成的cDNA保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴增。

2.2 引物設計與合成

根據華大基因公司測序的苦參轉錄組數據，從中篩選出hsp，利用Primer 5.0軟件設計出一對特異性的PCR引物來獲得hsp17.8的編碼序列。引物序列為H1:5′-CATATGATGGGAAAGGCACGCACCATTGG GGT-3′(下劃線為NdeⅠ的酶切位點)，H2:5′-CTCGAGCTGCCTGGAATTGGAAGATTGGTTTCC-3′(下劃線為XhoⅠ的酶切位點)，引物由上海生工生物公司合成。

2.3 PCR擴增目的基因hsp17.8

以合成的cDNA為模板，設計的H1、H2為引物對hsp17.8進行PCR擴增。25 μL反應體系：ddH2O 16 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，引物H1和H2 (5 μmol/ L)各1 μL，cDNA 2 μL，rTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 1.5 μL。PCR條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10個循環(huán)；接著94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；循環(huán)結束后在72℃下再延伸10 min。用核酸電泳對PCR擴增產物進行鑒定。

2.4 pMD19T-hsp17.8擴增質粒的構建

在紫外燈下用干凈的手術刀切下核酸膠中的目的DNA亮帶，此條帶用膠回收試劑盒純化(純化結果用核酸電泳檢測)，然后在16℃水浴下連接到pMD19-T Vector，連接體系：回收純化的DNA 11 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL，pMD19-T Vector 1.5 μL和T4 DNA Ligase 1 μL。用42℃，90 s熱激法將連接產物轉化到實驗室新制備的感受態(tài)細胞E．coliDH5α，先預培養(yǎng)1.5 h再涂布于Amp+的LB平板。次日，挑單克隆擴大培養(yǎng)。對菌液進行PCR鑒定，PCR體系和條件同上。同時用質粒小抽試劑盒制備重組質粒，為接下來的NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切做準備，雙酶切在37℃水浴下進行，體系為：Plasmid DNA 30 μL，10×H Buffer 3.8 μL，NdeⅠ 2 μL，XhoⅠ 2 μL。用核酸電泳檢測是否出現目的條帶。陽性菌液送上海生工生物技術有限公司測序。

2.5 pET22b-hsp17.8表達質粒的構建

將陽性重組擴增載體pMD19T-hsp17.8雙酶切后的帶有酶切位點的目的片段切割回收純化，與經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達載體 pET22b(+)于16℃連接過夜。連接體系為：回收純化的帶有酶切位點的DNA 9.5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.5 μL，pET22b(+) 3 μL和T4 DNA Ligase 1.2 μL。轉化、挑單克隆、菌液PCR鑒定、質粒抽提、NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定操作同上。用核酸電泳檢測是否出現目的條帶。陽性克隆送測序分析(上海生工生物技術有限公司)。

2.6 重組表達菌的誘導表達

將重組表達質粒pET22b-hsp17.8轉化E．coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取克隆于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將震蕩過夜培養(yǎng)的原核表達菌取3 mL接種到200 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基里，37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6左右時，加入IPTG使其終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L(其中0 mmol/L為不添加 IPTG的對照組)，將其分別在3個溫度(16℃、25℃和37℃)下誘導表達24 h、8 h和6 h，轉速為150 r/min。由于大腸桿菌在16℃、24h，25℃、8 h和37℃、6 h均達到生長穩(wěn)定期，延長時間蛋白質表達量不再增加，所以我們選擇了這些參數作為誘導蛋白產生的條件；高濃度的IPTG有毒性，會殺死細胞，且會增加外源蛋白表達速度，容易造成包涵體的形成，所以一般選擇IPTG終濃度為0.1～1 mmol/L，我們選擇了IPTG最小終濃度0.1 mmol/L和最大終濃度1 mmol/L以及它們的中間濃度0.5 mmol/L作為實驗組，以0 mmol/L為對照組，對熱應激蛋白的表達量做了比較。誘導結束后，8000 r/min 離心25 min收集菌體，用30 mL PBS(含500 mmol/L NaCl)/300 μL PMSF混勻收集的細菌，樣品放置冰上保持低溫，超聲(超聲1 s，停頓3 s，破碎次數共120次)將細菌完全破碎裂解。13 000 r/min離心30 min收集上清。樣品分別加入相應量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，進行后續(xù)的Western blot檢測。

2.7 Western blot

制備15%分離膠和5%濃縮膠，加樣，75V電泳30 min后切換115 V電泳90 min，電泳結束后切膠，轉膜、封閉、附一抗His-Tag 抗體 (1/1000)過夜、洗膜、附二抗anti-mouse IgG HRP(1/2500)、洗膜、曝光。

2.8 生物信息學分析

首先用在線翻譯工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html)對hsp17.8進行基因序列翻譯，接下來用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對HSP17.8蛋白的等電點、分子質量等物理化學性質進行預測。HSP17.8蛋白的潛在功能位點使用Motif scan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)進行預測。使用SMART BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/smartBlast.cgi)工具對HSP17.8進行同源序列的搜索，基于BLAST搜索結果用BoxShade Server (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)、Clustalx1.83和MEGA5.0軟件對HSP17.8進行同源蛋白的比對及進化樹分析。利用在線蛋白折疊識別工具PHYRE2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對HSP17.8的二級結構和三級結構進行預測和模擬，用PyMOL program軟件對HSP17.8蛋白的3D模型進行繪制。

3 結果與分析

3.1 苦參RNA的提取鑒定

從新鮮苦參葉片中提取的RNA經超純水稀釋1000倍，在酶標儀上測定其OD在260 nm和280 nm處的值，計算OD260/OD280的比值為1.92，結果在1.8和2.0之間，說明提取的RNA純度較好；同時對新提取的苦參總RNA進行核酸電泳檢測，紫外燈下顯示所提RNA有3條可見的明亮條帶，說明苦參RNA的完整性較好。雙重檢測的RNA基本無降解，可以用來合成cDNA (圖未顯示)。

3.2 目的基因hsp17.8的PCR鑒定

以合成的苦參cDNA為模板，H1、H2為引物，用rTaqDNA聚合酶做兩步PCR。PCR結果如圖1-A所示，凝膠上有分子質量在500 bp左右的明亮條帶，表明得到了預期大小的hsp17.8目的條帶。

3.3 pMD19T-hsp17.8擴增質粒的鑒定

將核酸膠上的hsp17.8目的條帶切割下來純化濃縮，與pMD19-T Vector連接，轉化入實驗室新制備感受態(tài)細胞E．coliDH5α培養(yǎng)，用菌液PCR和NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切對培養(yǎng)的重組菌進行雙重鑒定，結果如圖1-B和1-C所示，在分子質量500 bp左右處均出現清楚的目的條帶，說明pMD19T-hsp17.8擴增質粒構建成功。生工生物技術有限公司測序結果比對顯示此序列與苦參轉錄組數據里的序列(TR2941)完全匹配。

3.4 pET22b-hsp17.8表達質粒的鑒定

將經過NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET22b(+)和同樣經過NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切的目的基因用T4 DNA Ligase進行連接，轉化入實驗室新制備的感受態(tài)細胞E．coliDH5α，取單個克隆進行菌液PCR和NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切雙重鑒定，結果如圖1-D和1-E所示，在分子質量500 bp左右處也均出現清楚的目的條帶，說明pET22b-hsp17.8表達質粒構建成功。經生工生物技術有限公司再次測序，結果顯示此序列與上次測序結果完全匹配。

圖1 hsp17.8的克隆與重組載體的構建

A：hsp17.8的PCR擴增；B：含有pMD19T-hsp17.8重組質粒的菌液PCR；C：pMD19T-hsp17.8重組質粒的雙酶切結果；D：含有pET22b-hsp17.8重組質粒的菌液PCR；E：pET22b-hsp17.8重組質粒的雙酶切結果。箭頭示意目的條帶

3.5 Western blot結果分析

將上述重組表達質粒pET22b-hsp17.8轉入E．coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。在不同溫度、時間下用不同濃度的IPTG誘導表達，其蛋白表達情況通過Western blot檢測，檢測結果如圖2-A所示，在分子質量約17.8 ku處有明顯的條帶，與理論分子質量值相符，蛋白在上清中的表達量遠遠高于沉淀中的表達量(沉淀蛋白表達圖片未顯示)，說明此蛋白為可溶性蛋白?；赪estern blot檢測結果，用GraphPad Prism 6.0軟件對HSP17.8表達量進行繪圖分析，如圖2-B顯示，在溫度為16℃、IPTG終濃度為1 mmol/L，25℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L和37℃、IPTG終濃度為0.1 mmol/L條件下，HSP17.8蛋白表達量比較高，但總體比較結果是：在25℃、0.5 mmol/L IPTG條件下，苦參HSP17.8蛋白的表達量最高(*表示)，因此25℃、終濃度為0.5 mmol/L IPTG是HSP17.8的最佳體外表達條件。

圖2 熱應激蛋白HSP17.8的誘導表達情況及表達量的分析

A：Western blot結果(M為蛋白Marker；1、2、3、4代表在16℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時的蛋白表達情況；5、6、7和8代表在25℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時的蛋白表達情況；9、10、11和12代表在37℃下IPTG終濃度為0、0.1、0.5和1 mmol/L時的蛋白表達情況)。B：HSP17.8蛋白表達量的分析(*標示了最高表達量)

3.6 生物信息學分析

3.6.1 HSP17.8蛋白的物理化學性質分析

將HSP17.8編碼序列用在線工具(The Sequence Manipulation Suite)翻譯成氨基酸，再將氨基酸序列通過ProtParam (ExPaSy)軟件分析得到HSP17.8蛋白的分子質量、分子式、等電點、電荷性等一系列物理化學性質，結果如下表1所示。此蛋白的不穩(wěn)定性指數為26.44 (小于40)，說明此蛋白很穩(wěn)定，不容易降解；它的總平均親水性為-0.066，屬于負值，說明此蛋白為親水性蛋白，與Western blot結果顯示一致，即為可溶性蛋白。

3.6.2 HSP17.8蛋白的潛在功能位點預測

Motif Scan分析HSP17.8蛋白的氨基酸序列，發(fā)現一個3-磷酸甘油醛脫氫酶、輔酶結合域、3個蛋白激酶C磷酸化位點、2個N-蛋白質豆蔻酰化位點、3個酪蛋白激酶II磷酸化位點和3個N-糖基化位點，具體位置見表2；且K3-K157氨基酸序列與兩個應激蛋白非常相似，E值分別為3e-19和9.3e-19，遠遠小于10-6，說明此蛋白與應激蛋白同源性非常高，應該屬于應激蛋白家族中的一員。

表1 HSP17.8蛋白的物理化學性質

3.6.3 HSP17.8同源序列比對及進化樹構建

通過SMART BLAST在線軟件分析，根據蛋白的同源性在NCBI數據庫中搜索到HSP17.8蛋白相似度最高的13個同源蛋白，它們的序列號分別為大豆(Glycinemax)，NP_001237890.1；羽扇豆(Lupinusangustifolius)，XP_019459376.1；木豆(Cajanuscajan)，XP_020234148.1；豇豆(Vignaradiatavar.radiate)，XP_014504733.1；野生大豆(Glycinesoja)，KHN39491.1；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，XP_003616191.1；赤豆(Vignaangularis)，XP_017430444.1；赤豆(Vignaangularis)，XP_017430443.1；菜豆(Phaseolusvulgaris)，XP_007141947.1；地三葉草(Trifoliumsubterraneum)，GAU36776.1；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，XP_013454197.1；百脈根(Lotusjaponicas)，AFK43932.1；大豆(Glycinemax)，KRH72936.1。發(fā)現苦參HSP17.8與各種豆類的HSP同源性較高，這與苦參屬于豆科植物是一致的。用在線軟件BoxShade Server 和Clustalx1.83對HSP17.8及其相似度最高的13個同源蛋白進行比對，如圖3-A所示。使用MEGA5.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining Method, NJ)，步長值(Bootstrap values)設為1000的重復性對HSP17.8及其13個同源蛋白進行進化樹分析，如圖3-B所示，苦參的HSP17.8與羽扇豆的應激蛋白在同一個子分支中，相似度達到了90%，說明苦參與羽扇豆的應激蛋白同源性最高，兩物種之間的親緣關系最近。

3.6.4 苦參HSP17.8的二級結構分析及三級結構模擬

通過PHYRE2在線軟件，以得分最高的d1mjha為模板，獲得了HSP17.8蛋白的二級結構信息及三維結構模型(圖4)，氨基酸序列覆蓋率為86% (覆蓋HSP17.8的142個氨基酸殘基，它們分別為1M、4A-45A、63L-161S)，序列一致性為28%，可信度為99%。圖4-A結果顯示HSP17.8具有4個α螺旋(15A-27N、62P-93T、109E-114E、140S-148N)、5個β折疊(6T-10A、Q34-40V、97V-105G、121D-124V、153V-156V)。用三級結構繪圖軟件PyMOL對HSP17.8蛋白的3D結構進行繪制，如圖4-B所示，可以看出HSP17.8蛋白富含α螺旋和β折疊，α螺旋和β折疊依次出現，形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折疊方式，5個β折疊相同方向，被α螺旋包裹在內部，構成了蛋白質立體結構的內部框架。

表2 HSP17.8蛋白的潛在功能位點

圖3苦參HSP17.8的同源蛋白比對及進化樹分析

Fig 3 Homologous alignment and phylogenic tree of HSP17.8

A：HSP17.8與13個同源性最高的蛋白比對圖。B：HSP17.8的進化關系圖(0.02表示遺傳距離；枝干數字表示分支支持率)

4 討論

植物小分子熱激蛋白(small heat shock proteins, sHSP)在植物受到逆境脅迫下表達量明顯增加，提高了植物對各種逆境因子脅迫的防御能力，是一類重要的脅迫誘導蛋白[14]，被認為是植物抗逆過程中的第一道防線[15]。劉箭等[16]利用Northern雜交法發(fā)現高溫脅迫下，番茄花藥中細胞質和線粒體sHSP基因轉錄明顯，認為sHSP基礎含量的增加可減緩快速升溫對熱敏性花藥的傷害。Lund等[17]研究結果表明，在熱激誘導下玉米線粒體小分子HSP22相比大分子HSP70含量發(fā)生了明顯變化，認為線粒體小分子熱應激蛋白HSP22在分子水平、蛋白質水平和細胞器水平上對植物主要起保護功能，直接影響植物線粒體耐熱性。Sun等[18]研究發(fā)現過表達的At-HSP17.6A能夠提高擬南芥的耐鹽性和抗旱性，說明sHSP對逆境生理研究有著重要意義。

圖4 HSP17.8的二級結構及空間構型圖

A：苦參HSP17.8的二級結構圖(1、2、3、4分別代表預測的HSP17.8二級結構、HSP17.8的氨基酸序列、模板d1mjha的氨基酸序列、模板d1mjha的已知二級結構；綠色螺旋狀為α螺旋，淺藍色箭頭為β折疊)。B：苦參HSP17.8的3D模型圖(黃色箭頭表示β折疊；紅色螺旋表示α螺旋；綠色為無規(guī)卷曲；N-terminal為HSP17.8蛋白的氨基末端；C-terminal為HSP17.8蛋白的羧基末端)

基于sHSP的重要的生物學功能及其巨大的應用潛力，作者利用分子生物學手段首次從苦參中克隆了長度為498 bp的熱應激蛋白小分子家族HSP17.8基因，其編碼166個氨基酸，GenBank登錄號為MF101468，并成功在體外誘導其表達，該蛋白分子質量約為17.8 ku，等電點為8.55，是穩(wěn)定親水性蛋白。我們進一步篩選了其最佳的體外誘導表達條件，分析了該蛋白的理化性質、進化關系以及空間結構特點等，發(fā)現該蛋白與羽扇豆的應激蛋白同源性達到了90%，親緣關系最近，這與苦參是豆科植物是一致的。本研究為今后探索植物小分子熱激蛋白的誘導機理、結構功能以及在植物體內的抗逆機制奠定了基礎。

[1]GEORGOPOULOS C, WELCH W J. Role of the major heat shock proteins as molecular chaperones [J]. Annual Review of Cell Biology, 1993, 9:601-634.

[2]MOSELEY P L. Heat shock proteins and heat adaptation of the whole organism [J]. Journal of Applied Physiology, 1997, 83(5):1413-1417.

[3]KIANG J G, TSOKOS G C. Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochemistry, and physiology [J]. Pharmacology Therapeutics, 1998, 80(2):183-201.

[4]鮑恩東, 龔遠英, HARTUNG J, 等. 肉雞熱應激病理損傷與應激蛋白(HSP70)相關性研究[J]. 中國農業(yè)科學, 2004, 37(2): 301-305.

[5]YU Z F, MATTSON M P. Dietary restriction and 2-deoxyglucose administration reduce focal ischemic brain damage and improve behavioral outcome: evidence for a preconditioning mechanism [J]. Journal of Neuroscience Research, 1999, 57(6):830-839.

[6]WANG Z, INOKUCHI T, NEMOTO T K, et al. Antisense oligonucleotide against collagen-specific molecular chaperone 47-kDa heat shock protein suppresses scar formation in rat wounds [J]. Plastic & Reconstructive Surgery, 2003, 111(6):1980-1987.

[7]沈 驊, 王曉蓉, 張景飛. 應用應激蛋白HSP70作為生物標志物研究鋅、銅及其聯合毒性對鯽魚肝臟的影響[J]. 環(huán)境科學學報, 2004, 24(5): 895-899.

[8]陳 忠, 蘇維埃, 湯章城. 豌豆熱激蛋白Hpc60對酶的高溫保護功能及其機理[J]. 科學通報, 1999, 44(20):2171-2175.

[9]COLLINS G G, NIE X L, SALTVEIT M E. Heat shock proteins and chilling sensitivity of mung bean hypocotyls [J]. Journal of Experimental Botany, 1995, 46(288):795-802.

[10]COCA M A, ALMOGUERA C, THOMAS T L, et al. Differential regulation of small heat-shock genes in plants: analysis of a water-stress-inducible and developmentally activated sunflower promoter [J]. Plant Molecular Biology, 1996, 31(4):863-876.

[11]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:附錄202-203.

[12]WANG W, YOU R L, QIN W J, et al. Anti-tumor activities of active ingredients in compound Kushen injection [J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2015, 36(6):676-679.

[13]JIN J H, KIM J S, KANG S S, et al. Anti-inflammatory and anti-arthritic activity of total flavonoids of the roots of Sophoraflavescens[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 127(3):589-595.

[14]WANG W, VINOCUR B, SHOSEYOV O, et al. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science, 2004, 9(5):244-252.

[15]SUN W, VAN MONTAGU M, VERBRUGGEN N. Small heat shock proteins and stress tolerance in plants [J]. Biochimicaet Biophysica Acta, 2002, 1577(1):1-9.

[16]劉 箭, 莊野真理子. 小分子熱激蛋白基因在番茄花藥中的轉錄[J]. 園藝學報, 2001, 28(5): 403-408.

[17]LUND A A, BLUM P H, BHATTRAMAKKI D, et al. Heat-stress response of maize mitochondria [J]. Plant Physiology, 1998, 116(3):1097-1110.

[18]SUN W, BERNARD C, VAN DE COTTE B, et al. At-HSP17.6A, encoding a small heat-shock protein in Arabidopsis, can enhance osmotolerance upon overexpression [J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2001, 27(5):407-415.