張振東，劉希望，馬 寧，申棟帥，李劍勇

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

固相萃?。⊿olid-phase extraction，SPE）是近年發(fā)展起來一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。其原理是利用組分與吸附劑（固定相）間的選擇性吸附與選擇性洗脫過程，達到分離、凈化和富集的目的[1]。SPE技術(shù)與傳統(tǒng)的液液萃取法相比有以下優(yōu)點：（1）在樣品分離、純化和濃縮時，可以提高藥物回收率；（2）選擇性好，將藥物與干擾組分更加有效分離；（3）可實現(xiàn)多樣品平行處理，便于自動化，有較高的重現(xiàn)性，有助于提高檢測靈敏度；（4）SPE柱的商品化，使其萃取操作更簡單、省時[2]。SPE最普遍使用的形式是SPE柱。SPE柱是一種填充好固定相的短色譜柱。當液體樣品通過固相吸附層時，基體被除去，待測物被富集，然后用少量溶劑（6～10 mL）洗脫回收待測物[3]。乙酰氨基阿維菌素（Eprinomectin，EPR）是高效、廣譜、低殘留的獸用最新一代祛蟲藥物，主要用于防治畜類（特別是產(chǎn)乳期）的虱、螨、蠅等各種體內(nèi)外寄生蟲，應(yīng)用于奶牛和肉牛的休藥期僅為1 d[4]。由于其對家畜體內(nèi)外各種寄生蟲的極高活性，以及在乳品中極低的分配系數(shù)，使其成為第一個可用于各種家畜任何生長期的殺蟲劑，是一種防治家畜體內(nèi)外各種寄生蟲的首選藥劑。EPR脂溶性較高，對其提取和凈化較為困難。EPR在動物血液中殘留時間較長，因此在動物血液檢測中常先用SPE柱對樣品進行凈化，再經(jīng)過衍生化，最后用超高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）進行分析檢測[5]。本試驗通過比較兩種SPE柱的EPR凈化、萃取效果，為后期EPR的藥物代謝動力學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標準品 乙酰氨基阿維菌素（B1a含量為95.4%，B1b含量為2.37%，批號K0471411）：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2主要試劑 乙睛、甲醇、色譜純：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；冰醋酸、分析純：天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn)；N-甲基吡咯烷酮（含量99%）：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；三氟乙酸酐（含量99%）：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；蒸餾水、屈臣氏蒸餾水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司生產(chǎn)；甲酸、質(zhì)譜純（含量98%）：日本化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器設(shè)備 高效液相色譜儀（Agilent-LC 1290II）、調(diào)速振蕩器（VORTEX-2，GENIE?）： 美 國 Scientific Industries公 司 產(chǎn)品；快速蒸發(fā)器（LABCONCO?PapidVap）：美國LABCONCO公司產(chǎn)品；離心機（MULTIFUGEX3R）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)；SPE柱（Bond Elut C18、500 mg、6 mL）：Agilent科技（中國）有限公司生產(chǎn)；SPE 柱（Sep-pak C18、500 mg、6 mL）：Waters科技（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.1.4主要溶液配制 衍生化A液：N-甲基咪唑+乙睛（2+7，v/v）；衍生化B液：三氟乙酸酐+乙腈（2+7，v/v）。現(xiàn)配現(xiàn)用。標準儲備液的配制：精密稱取EPR 102 mg，配制成1.02 mg/mL的A標準儲備液，20.4 μg/mL的B標準儲備液，2.04 μg/mL的C標準儲備液，?20 ℃避光保存。

1.2 方法

1.2.1色譜條件及參數(shù) 色譜柱：C18反相色 譜 柱（Eclipse plus C18，RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：乙腈∶水（0.1%的甲酸）=90∶10；流速0.4 mL/min；激發(fā)波長365 nm；檢測波長 463 nm；柱溫35 ℃；進樣量 20 μL；檢測時間10 min。

1.2.2EPR標準溶液的衍生化與測定 取10 μL 2.04 μg/mL的C標準儲備液于磨口的玻璃離心管中，在40 ℃快速蒸發(fā)器中吹干；在上述干燥樣品中（裝于磨口玻璃離心管中）加入200 μL衍生化試劑A液，震蕩混勻1 min；加入200 μL衍生化試劑B液，震蕩混勻1min；最后加入45 μL冰醋酸，迅速蓋上蓋，震蕩混勻0.5 min。將整個具蓋玻璃管置于65 ℃烘箱中衍生化反應(yīng)30 min，室溫放置12 min。用流動相定容至1 mL，混勻后過0.22 mm針筒濾膜，進行HPLC分析檢測。共進行6次平行試驗，對結(jié)果求平均值及相對標準偏差。

1.2.3血漿樣品處理、SPE C18柱萃取、衍生化與測定 從?20 ℃中取出冷凍的空白胎牛血清，待其恢復(fù)至室溫后，取樣品0.5 mL，向其中加入10 μL 2.04 μg/mL的C標準儲備液，渦旋3 min，靜置30 s，然后加入3.5 mL甲醇震蕩，混勻20 min，4 000 g離心20 min，合并上清液，提取2次。向上清中加入7 mL蒸餾水（約1∶1稀釋），震蕩混勻備用。此時應(yīng)先依次使用3 mL甲醇、3 mL超純水、3 mL 70%甲醇水溶液，對C18SPE柱進行平衡，然后將混勻后的液體通過C18SPE柱進行萃取，使用3 mL蒸餾水、3 mL 50%甲醇水溶液進行淋洗；使用洗耳球?qū)PE柱吹干后，使用6 mL甲醇，平均分3次，每次2 mL進行洗脫。將洗脫液收集在磨口的玻璃離心管中，40 ℃下用快速蒸發(fā)儀吹干。在上述干燥樣品中（裝于磨口玻璃離心管中）加入200 μL衍生化試劑A液，震蕩混勻1 min，加入200 μL衍生化試劑B液，震蕩混勻1 min，最后加入45 μL冰醋酸，迅速蓋上蓋，震蕩混勻0.5 min。將玻璃蓋蓋緊；將整個具蓋玻璃管置于65 ℃烘箱中衍生化反應(yīng)30 min，室溫放置12 min；用流動相定容至1 mL，混勻后過0.22 mm針筒濾膜，進行HPLC分析檢測。對這兩種SPE柱分別進行6次平行試驗，求其平均絕對回收率及相對標準偏差。

1.2.4絕對回收率計算 絕對回收率=經(jīng)SPE柱萃取的樣品藥物峰面積/藥物標準品峰面積。

2 結(jié)果

2.1 EPR及其經(jīng)不同SPE柱萃取后的衍生化

EPR及其經(jīng)不同SPE柱萃取后的衍生化結(jié)果見表1。

表1 EPR及EPR經(jīng)不同SPE柱萃取后的衍生化結(jié)果

2.2 EPR衍生化峰圖

由數(shù)據(jù)和圖譜可得（圖1、圖2、圖3、圖4和圖5），經(jīng)Agilent公司的C18SPE柱萃取后，EPR峰形尖銳對稱且無明顯雜質(zhì)峰，其平均絕對回收率為94.50%；經(jīng)Waters公司的C18SPE柱萃取后，EPR峰形尖銳對稱且無明顯雜質(zhì)峰，其平均絕對回收率為85.79%。Agilent公司的C18SPE柱與Waters公司的C18SPE柱凈化效果相似，但是Agilent公司的C18SPE柱比Waters公司的C18SPE柱萃取EPR的效率更高。

圖1 EPR標準溶液的衍生化

圖2 Agilent C18 SPE柱-空白血漿衍生化

圖3 Waters C18 SPE柱-空白血漿衍生化

圖4 AgilentC18 SPE柱-EPR樣品衍生化

圖5 Waters C18 SPE柱-PER樣品衍生化

3 討論

近年來，隨著人們對EPR藥物殘留及代謝的深入研究，特別是在樣品前處理中，越來越多的用到了SPE技術(shù)[6]。Nordlander等[7]使用C18SPE柱凈化豬肌肉中的伊維菌素，以高效液相-熒光（HPLC-FLD）檢測法進行測定。潘保良等[8]應(yīng)用C18SPE柱凈化技術(shù)，建立了綿羊血漿中伊維菌素HPLC-FLD檢測法。劉迎貴等[9]應(yīng)用C18SPE柱凈化技術(shù)，建立了牛、羊、豬肉組織中的伊維菌素殘留檢測方法。文輝強等[10]在兩種EPR澆潑劑在兔體內(nèi)藥代動力學的比較研究中，經(jīng)過C18SPE柱凈化，建立了一套完整的阿EPR澆潑劑HPLC-FLD檢測法。高三玉等[11]在高效液相色譜法測定牛奶中EPR殘留量研究中，利用C18SPE柱凈化，應(yīng)用HPLC-FLD檢測法，建立了一種測定牛奶中EPR殘留量的高效液相色譜方法。Dupuy等[12]等利用Agilent公司的C18SPE柱，對水牛血漿進行前處理，利用HPLC-FLD檢測法研究了EPR澆潑劑在泌乳期水牛體內(nèi)的藥代動力學。Baoliang等[13]進行了EPR注射液在泌乳奶牛體內(nèi)的藥代動力學研究，將奶牛血漿經(jīng)過Waters公司的C18SPE柱萃取后，以HPLC-FLD檢測法繪制了藥時曲線。Wen等[14]進行了EPR澆潑劑和口服糊劑在泌乳期奶牛體內(nèi)的藥物動力學研究，利用C18SPE柱前處理，以HPLC-FLD檢測法繪制了兩種劑型的藥時曲線。

4 結(jié)論

本研究表明，Agilent公司和Waters公司的C18SPE柱對EPR的凈化效果相似，但Agilent公司的C18SPE柱萃取效率更高。SPE技術(shù)在藥物代謝動力學中的應(yīng)用越來越廣泛，篩選出一種優(yōu)質(zhì)SPE柱是進行藥物代謝動力學試驗的良好開端，也是試驗成功的重要保障。

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