張志妮，郭中敏，嚴(yán) 楚

（1. 中山大學(xué)，廣東廣州 510006；2. 廣州市白云區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所鐘落潭鎮(zhèn)分所，廣東廣州 510550）

小鼠肝炎病毒（（Mouse hepatitis virus，MHV）是一種高傳染性，可造成小鼠肝炎并在小鼠群中劇烈暴發(fā)并遍及全球的病毒[1]，屬日冕冠狀病毒科冠狀病毒屬，有囊膜，線性不分段的單股正鏈RNA病毒[1-2]，主要經(jīng)過空氣和接觸傳播。在自然界中，小鼠是其唯一易感動(dòng)物。該病毒多數(shù)情況下引起亞臨床感染或慢性感染，應(yīng)激或機(jī)體抵抗力下降時(shí)可引起急性發(fā)病和死亡，是對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一[2]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒檢測(cè)方法》（GB/T 14926.22—2001）規(guī)定的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（Immunofluorescence assay，IFA）和免疫酶試驗(yàn)（Immunoenzyme assay，IEA）。如ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，經(jīng)IFA檢測(cè)仍為陽(yáng)性，方可判為陽(yáng)性結(jié)果。本研究分析了26份小鼠血清樣本的ELISA、IFA檢測(cè)結(jié)果，初步評(píng)價(jià)了兩種方法的真實(shí)性，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房MHV日常監(jiān)測(cè)提供了借鑒。

1 材料與方法。

1.1 材料

MHV ELISA Kit：購(gòu)自EBI-xpress Biotech International；小鼠肝炎病毒免疫熒光（IFA）試劑盒：購(gòu)自蘇州西山生物技術(shù)有限公司；待測(cè)樣品：近2年來自不同屏障設(shè)施的26份SPF級(jí)小鼠血清。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀：Multiskan Ascent，美國(guó)Thermo。智能型生物顯微鏡：LEICA DM5000B，德國(guó)Leica。恒溫振蕩儀：ZD-85，中國(guó)金壇富華。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1ELISA試劑盒 檢測(cè)過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測(cè)樣品按1∶50的體積比稀釋（待檢血清∶樣本稀釋液=10∶490），對(duì)結(jié)果使用Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)讀值。陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清均為試劑盒自帶。

1.3.2IFA試劑盒檢測(cè) 檢測(cè)過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測(cè)樣品按1∶25的體積比稀釋（待檢血清∶樣本稀釋液=5∶120），使用LEICA DM5000B智能型生物顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清均為試劑盒自帶。鏡下判讀標(biāo)準(zhǔn)：僅有紅色細(xì)胞背景為“?”，僅見黃綠色熒光為“+”，可見明亮的綠色與黃色熒光為“++”，耀眼的綠色與黃色熒光為“+++”。

1.3.3檢測(cè)效果初步評(píng)價(jià) 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，首先制作四格表（表1），再根據(jù)表格數(shù)據(jù)計(jì)算相應(yīng)指標(biāo)。靈敏度=a/（a+c）×100%，特異度=d/（b+d）×100%，誤診率=b/（b+d）×100%，漏診率=c/（a+c）×100%，粗一致率，即準(zhǔn)確度=（a+d）/（a+b+c+d）×100%，約登指數(shù)，即正確指數(shù)=[a/（a+c）+d/（b+d）]–1，陽(yáng)性似然比=[a/（a+c）]/[b/（b+d）]×100%，陰性似然比=[c/（a+c）]/[d/（b+d）]×100%[3]。

表1 ELISA、IFA檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)

2.1.1結(jié)果有效性判定 陰性對(duì)照血清的陽(yáng)性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對(duì)照抗原孔讀數(shù)必須＜0.250，陽(yáng)性對(duì)照血清的陽(yáng)性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對(duì)照抗原孔讀數(shù)必須＞0.600，否則需重新檢測(cè)。本試驗(yàn)試劑盒自帶陰性對(duì)照血清ΔOD為0.012，陽(yáng)性對(duì)照血清ΔOD為2.883，證實(shí)有效（表2）。

2.1.2待測(cè)樣本結(jié)果判定 ΔOD=抗原孔讀數(shù)OD值?對(duì)照抗原孔OD值，ΔOD≥0.300，結(jié)果判為陽(yáng)性（P），ΔOD＜0.300，結(jié)果判為陰性（N）。26份血清中，有15份陽(yáng)性、11份陰性（表2）。

2.2 IFA檢測(cè)

2.2.1結(jié)果有效性判定 陰性對(duì)照血清的陽(yáng)性感染細(xì)胞孔和陰性對(duì)照細(xì)胞孔均為“?”，陽(yáng)性對(duì)照血清的陽(yáng)性感染細(xì)胞孔判讀為“+～+++”，陰性對(duì)照細(xì)胞孔為“?”則本次試驗(yàn)有效，否則需重新檢測(cè)。本試驗(yàn)試劑盒自帶陰性對(duì)照血清陽(yáng)性感染細(xì)胞孔和陰性對(duì)照細(xì)胞孔均為“?”，陽(yáng)性對(duì)照血清的陽(yáng)性感染細(xì)胞孔判讀為“++”，陰性對(duì)照細(xì)胞孔為“?”，證實(shí)有效（表2）。

2.2.2樣本結(jié)果判定 26份血清中，有13份顯示陽(yáng)性，其中5份為“+”，8份為“++”，剩余13份血清結(jié)果顯示陰性（表2）。

2.3 ELISA和IFA檢測(cè)結(jié)果真實(shí)性評(píng)價(jià)

26份血清中，有13份均被ELISA和IFA檢測(cè)均為陽(yáng)性、11份均為陰性，另2份分別為ELISA檢測(cè)陽(yáng)性、IFA檢測(cè)陰性。根據(jù)表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果，參比IFA，ELISA檢測(cè)試劑盒的真實(shí)性指標(biāo)為：靈敏度100%，特異度84.61%，誤診率15.38%，漏診率0，準(zhǔn)確度92.3%，正確指數(shù)0.846，陽(yáng)性似然比650%，陰性似然比0。

表2 樣品的ELISA、IFA檢測(cè)結(jié)果

表3 ELISA、IFA檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 單位：份

3 討論

MHV是我國(guó)清潔級(jí)或以上級(jí)別實(shí)驗(yàn)小鼠應(yīng)排除的病原之一，是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》（GB 14922.2—2011）規(guī)定的必檢項(xiàng)目，2013年首次被納入新版《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》。

1949年Cheever首次在后肢癱瘓小鼠腦中首次分離到MHV-JHM 株，隨后鑒定出其他毒株。我國(guó)1979年于裸鼠中發(fā)現(xiàn)并分離到該病毒[4]。近年來的血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，2004—2007年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的MHV陽(yáng)性率為3.4%～12%[5]，2000—2003年歐洲為12%，北美為1.59%[6]；2003—2007年我國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的檢出率為3%～7%[7]，湖南省疾病預(yù)防控制中心在湖南省醫(yī)藥科研單位和藥廠飼養(yǎng)動(dòng)物中的陽(yáng)性檢出率為2.7%～6.8%[8]，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所在廣東省6個(gè)屏障設(shè)施中的陽(yáng)性檢出率為2%～13.7%[6]；2011年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所在11家繁殖區(qū)域送檢的動(dòng)物中均檢出陽(yáng)性[9]；北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司在2012—2013年國(guó)內(nèi)送檢小鼠中的陽(yáng)性檢出率高達(dá)19.9%[10]；2015年在廣東省舉辦的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)交流會(huì)上，北京、上海和廣東監(jiān)督檢驗(yàn)站報(bào)告在近5年來的檢測(cè)工作中均有陽(yáng)性被檢出。雖然不同時(shí)間、不同單位的監(jiān)測(cè)結(jié)果不盡相同，但不難發(fā)現(xiàn)，MHV感染情況較為普遍，抗體陽(yáng)性率較高。因此，對(duì)于MHV污染的防控，日常監(jiān)控尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠人工感染MHV后，抗體產(chǎn)生周期短，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，5～7 d 內(nèi)IgG明顯升高，3周時(shí)達(dá)到高峰，維持到28 d后開始緩慢下降；而IgM水平上升時(shí)間更早，3 d開始升高，7 d達(dá)高峰，3周后開始下降[11]。而更換“臟墊料”法自然感染的ICR小鼠陽(yáng)性抗體持續(xù)至84 d未見明顯降低；在接觸病原2 d內(nèi)，在肺臟中檢出病毒陽(yáng)性，隨后在其他組織樣本均檢出陽(yáng)性，14 d后，病毒檢出率開始下降，84 d后所有組織樣本中均未檢出病毒[12]。可見，抗原可作為早期檢測(cè)的輔助手段，而抗體檢測(cè)具有較高穩(wěn)定性，適用于MHV日常監(jiān)控，同時(shí)IgM亦可考慮用于早期感染的血清學(xué)檢測(cè)。

靈敏度高是ELISA、IFA的優(yōu)點(diǎn)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.22—2001規(guī)定，MHV檢測(cè)方法為ELISA、IFA和IEA。鑒于IEA法抗原不易制備，而ELISA、IFA均有商品化檢測(cè)試劑盒，故對(duì)于日常大量樣本的MHV快速檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)單位一般采用ELISA 初篩，陽(yáng)性樣本用IFA進(jìn)行復(fù)檢。因此，選擇適合的ELISA、IFA檢測(cè)試劑盒尤為關(guān)鍵。

前期預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果差強(qiáng)人意，故選擇了進(jìn)口試劑盒。13份檢測(cè)均為陽(yáng)性的結(jié)果中，ELISA檢測(cè)數(shù)值大小與IFA不一致，估計(jì)為兩種檢測(cè)試劑盒包被的抗原不一致所致。

4 結(jié)論

本次試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了ELISA和IFA兩種進(jìn)口試劑盒，反觀兩者符合度高。ELISA檢出率略高，有2份樣品ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性，但I(xiàn)FA檢測(cè)卻為陰性，進(jìn)一步證實(shí)了初篩使用ELISA方法的必要性；參比，IFA，ELISA試劑盒的靈敏度為100%，特異度為84.61%，準(zhǔn)確度為92.3%，正確指數(shù)為0.846，數(shù)據(jù)客觀真實(shí)，初步證實(shí)ELISA試劑盒配合IFA適用于動(dòng)物房MHV抗體的日常監(jiān)測(cè)。但仍需擴(kuò)大樣本量對(duì)該檢測(cè)方法的真實(shí)性進(jìn)行數(shù)據(jù)補(bǔ)充和修正，同時(shí)需應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行可靠性指標(biāo)檢測(cè)。只有這樣，才能較為客觀、真實(shí)地反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域的MHV感染率。

[1] 赫什D C. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 王鳳陽(yáng)，譯. 2版. 北京：科學(xué)出版社，1983.

[2] CHARLES B C，COSENTINO J M. Contemporary prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats[J]. Laboratory animal，2009，43（2）：165-173.

[3] 崔相學(xué). 衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)[M[. 1版. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009.

[4] 仇保豐，宋鴻雁，董蓉蓮，等. 鼠痘、小鼠肝炎和鼠仙臺(tái)病毒感染癥的國(guó)內(nèi)流行情況及防控對(duì)策[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（10）：9-14.

[5] LIANG C T. Microbial contaminations of laboratory mice and rats in taiwan from 2004 to 2007 [J]. Journal of the american association for laboratory animal science，2009，48（4）：381-386.

[6] 劉香梅，張鈺，趙維波，等. 廣東省屏障設(shè)施小鼠群中小鼠肝炎病毒感染情況[J] .中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（10）：72-74.

[7] 隋麗華，范薇，楊 敬，等. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、寄生蟲抽樣調(diào)查及分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28（4）：259-262.

[8] 黃凰，戴德芳，黃一偉，等. 湖南省2003—2007年實(shí)驗(yàn)大、小鼠病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15（6）：1926-1928.

[9] 魏巍，劉霄磊，劉家森，等. 大小鼠主要病毒血清抗體檢測(cè)結(jié)果與分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2011，28（6）：23-25.

[10] 王翠娥，陳立超，周倩，等. 實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠多種病毒的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2014，31（2）：20-24.

[11] 高駿，孫鳳萍，王勝昌，等. 實(shí)驗(yàn)小鼠感染小鼠肝炎病毒后的抗體變化[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（1）：8-11.

[12] 劉香梅，趙維波，袁文，等. ICR小鼠自然感染小鼠肝炎病毒后抗原抗體的變化[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（7）：37-40.