王海艷，趙治國，催 強(qiáng)，郭文秀，陳宇飛，趙林立

（內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

志賀氏菌對許多國家和地區(qū)的人類健康造成了嚴(yán)重危害。特別在不發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家，由于缺乏清潔的水源和必要的衛(wèi)生醫(yī)療設(shè)備等，由其引發(fā)的公共衛(wèi)生問題更加嚴(yán)重[1-2]。大多數(shù)志賀氏菌病由3種志賀氏菌引起，即福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和痢疾志賀氏菌。近年來，由于多種耐藥志賀氏菌株的出現(xiàn)，許多國家和地區(qū)的志賀氏菌病病例數(shù)量不斷增加。志賀氏菌病的早期確診需要準(zhǔn)確、快速的檢測方法。目前，對志賀氏菌的鑒定分群仍然依靠常規(guī)生化鑒定方法、免疫學(xué)方法。但這些方法復(fù)雜、耗時(shí)、耗力、敏感性低。一些學(xué)者研究建立了針對志賀氏菌屬的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，這些傳統(tǒng)PCR方法存在一定的局限性，容易出現(xiàn)誤檢或漏檢。因此，建立一種準(zhǔn)確、可靠、快捷的志賀氏菌鑒定和分群方法尤為重要。

本研究根據(jù)志賀氏菌的獨(dú)特基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分析。設(shè)計(jì)的引物用于檢測志賀氏菌屬，同時(shí)對臨床上與志賀氏菌病有關(guān)的3種志賀氏菌（即福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和痢疾志賀氏菌）進(jìn)行分群，以彌補(bǔ)目前志賀氏菌分子生物學(xué)檢測方法的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1引物 根據(jù)志賀氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB 等基因，利用引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http∶//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）分別設(shè)計(jì)的引物，用于鑒定志賀氏菌屬、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀菌和痢疾志賀菌，并以根據(jù)ompA基因設(shè)計(jì)的引物為參照。引物由上海奧吉生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.1.2主要試劑 志賀氏菌增菌肉湯、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基：購于北京陸橋公司；Tris Base、EDTA、溶菌酶、異硫氰酸胍、sarkosyl、 Taq酶、dNTPs、PCR緩沖液、溴化乙錠、分子量100 bp DNA Ladder Marker（100～1 500 bp）：購自大連寶生物公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖（電泳級）和其它試劑：國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器設(shè)備 低溫冷凍高速離心機(jī)、微量移液器、PCR儀、電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.4菌株 福氏志賀氏菌株（CMCC51571、CMCC51572、ATCC12022、CMCC51579、CMCC51240），鮑氏志賀氏菌株（CMCC51346、CMCC51585、CMCC51586、ATCC9207），宋內(nèi)志賀氏 菌 株（CMCC51592、ATCC11060、ATCC29930、ATCC25931、CMCC51334），痢 疾 志 賀 氏 菌 株（CMCC51105、CMCC51570、CMCC51252）， 單增李斯特氏菌CMCC54002株，英諾克李斯特氏菌ATCC33090株，威氏李斯特氏菌ATCC35897株，斯氏李斯特氏菌ATCC35967株，格氏李斯特氏菌ATCC25401株，枯草芽孢桿菌CMCC63501-21株，大腸桿菌CMCC44116株，沙門氏菌CMCC50079株，金黃色葡萄球菌CMCC26001株，乙型溶血型鏈球菌CMCC32210株，肺炎克雷白氏菌CMCC46114株，弗氏檸檬酸桿菌CMCC48001株，阪崎腸桿菌ATCC29544株，蠟樣芽孢桿菌CMCC63303株，陰溝腸桿菌ATCC13047株，綠膿桿菌ATCC27853株，小腸結(jié)腸耶爾森氏菌ATCC23715株，綿羊李斯特氏菌ATCC19119，大腸桿菌O157∶H7 ATCC43895株：購自中國藥品生物制品檢定所和上海漢尼公司：

1.1.5樣品 消毒鮮奶、雪糕、酸奶、香腸、熟肉和生肉：購于超市；原奶：購于個(gè)體養(yǎng)牛場；奶粉：送檢樣品。

1.2 方法

1.2.1PCR特異性檢測

1.2.1.1細(xì)菌培養(yǎng) 將所有細(xì)菌接種于TSB-YE中，37 ℃培養(yǎng)1 d。分別取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，8 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀用0.5 mL TE 洗1次，然后直接用于DNA提取或存于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2DNA提取 參照Pitcher等[3]方法進(jìn)行。將沉淀干燥后用60～70 μL滅菌雙蒸水溶解，將其直接用于PCR或存于?20 ℃冰箱中備用。

表1 本研究所用的引物

1.2.1.3PCR擴(kuò)增 以提取的細(xì)菌DNA為模板，分別用各對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為 25 μL：模板 DNA 2 μL，EX Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，10×EX Taq Buffer 2.5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）各1 μL，上游引物（10 pmol/ μL）1 μL，下游引物（10 pmol/ μL）1 μL，滅菌蒸餾水17.25 μL；循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，gen、flex和ctr引物65 ℃（son引物67 ℃，dys引物63 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸3 min；用3%瓊脂糖凝膠電泳后分析結(jié)果。

1.2.2PCR敏感性試驗(yàn)

1.2.2.1細(xì)菌定量接種與培養(yǎng) 按1～3、12、27、53、105 cfu/（25 g·mL-1）的量，將各株志賀氏菌分別接種到加入25 mL滅菌生理鹽水的225 mL 志賀氏菌增菌肉湯中（接菌的同時(shí)用志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)），并設(shè)未加菌的陰性對照，于41.5 ℃，厭氧培養(yǎng)18 h；各取1 mL培養(yǎng)物，8 000 r/min離心5 min；將沉淀用0.5 mL TE 緩沖液（pH 8. 0）懸起，移入1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min；棄盡上清后，直接用于DNA提取或存于?20 ℃冰箱中備用。

1.2.2.2DNA提取 方法同 1.2.1.2。

1.2.2.3PCR擴(kuò)增 方法同1.2.1.3。

1.2.3抗干擾試驗(yàn) 將志賀氏菌與非志賀氏菌屬細(xì)菌（乙型溶血性鏈球菌）混合物按相應(yīng)接種量，分別接種志賀氏菌增菌肉湯（接菌的同時(shí)用志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)）。按照1.2.2的方法進(jìn)行培養(yǎng)、核酸提取和PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，同時(shí)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法（GB 4789.5）作對比試驗(yàn)。

1.2.4人工接種樣品驗(yàn)證試驗(yàn) 將消毒鮮奶、雪糕、酸奶、香腸、熟肉、生肉、原奶和奶粉，各取5個(gè)樣，經(jīng)常規(guī)方法檢驗(yàn)無志賀氏菌污染后，用作PCR檢測方法的人工接種試驗(yàn)。每個(gè)樣取25 g/mL加入到225 mL志賀氏菌增菌肉湯中；均質(zhì)后，按相應(yīng)細(xì)菌量進(jìn)行人工接種試驗(yàn)，并按1.2.2中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)、DNA提取及PCR擴(kuò)增；同時(shí)將增菌肉湯劃線接種于志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，挑取可疑菌落進(jìn)行PCR鑒定；采用ISO的傳統(tǒng)培養(yǎng)法作對比試驗(yàn)。

1.2.5實(shí)際樣品檢測 對本實(shí)驗(yàn)室送檢的和市場上購買的1 100份樣品進(jìn)行檢測，并與ISO的傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR特異性確定

引物genF/genR，除了非志賀氏菌屬細(xì)菌外，在所有志賀氏菌屬細(xì)菌中都擴(kuò)增出了878 bp的特異性片段（圖1-A）；引物flexF/flexR，僅在福氏志賀氏菌擴(kuò)增出539 bp片段，其它志賀氏菌屬細(xì)菌和非志賀氏菌屬細(xì)菌均未擴(kuò)增出相應(yīng)大小片段（圖1-B）；引物sonF/sonR，僅在宋內(nèi)志賀氏菌可擴(kuò)增出434 bp片段，其它志賀氏菌屬細(xì)菌和非志賀氏菌屬細(xì)菌均未擴(kuò)增出相應(yīng)大小片段（圖1-C）；引物dysF/dysR，僅在痢疾志賀氏菌可擴(kuò)增出214 bp片段，其它志賀氏菌屬細(xì)菌和非志賀氏菌屬細(xì)菌均未擴(kuò)增出相應(yīng)大小片段（圖1-D）；引物ctrF/ctrR，在所有細(xì)菌中均能夠擴(kuò)增出1 322 bp的特異性片段（圖1-E）。

2.2 PCR敏感性檢測

以生理鹽水替代食品，分別將福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和痢疾志賀氏菌定量接種于志賀氏菌增菌肉湯中，兩步增菌后進(jìn)行PCR檢測，可見增菌后 PCR 的最低檢出限為 1～3 cfu/（25 g·mL-1），證明該P(yáng)CR方法具有極高的敏感性（圖2）。

2.3 抗干擾試驗(yàn)

通過試驗(yàn)可見，在人工污染干擾菌的情況下，本試驗(yàn)建立的PCR方法和培養(yǎng)法均可檢出志賀氏菌，但培養(yǎng)法比較費(fèi)力。在非志賀氏菌屬細(xì)菌存在的情況下，由于在增菌肉湯中加入了抑菌劑，使得非志賀氏菌屬細(xì)菌的生長受到抑制，所以采用兩種方法均比較容易檢出目標(biāo)菌（表2）。

表2 志賀氏菌抗乙型溶血性鏈球菌干擾的試驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 PCR敏感性檢測結(jié)果

2.4 人工污染食品中志賀氏菌的檢出情況

將人工污染樣品于41.5 ℃18 h增菌后的增菌肉湯直接進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香腸中的志賀氏菌檢出限為1～3 cfu/（25 g·mL-1），在原奶、生肉和奶粉中的檢出限分別為≤ 12、27 和≤ 27 cfu/（25 g·mL-1）。將增菌肉湯劃線接種于固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后再進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)在所有檢樣中均能檢測到志賀氏菌，與GB4789.5傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測限一致，均達(dá)到了1～3 cfu/（25 g·mL-1），證明該 PCR 方法適合不同類型樣品的常規(guī)檢測分析（表3）。

2.5 實(shí)際樣品檢測

對本實(shí)驗(yàn)室送檢的1 100份樣品進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法（GB 4789.5）進(jìn)行比較，均未分離到志賀氏菌，與GB4789.5的傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致。

3 討論

目前，國內(nèi)外有許多研究者建立了食品中志賀氏菌屬的PCR檢測方法，如國外Houng等[4]建立的志賀氏菌屬的PCR檢測方法。但其建立的方法因存在一定的局限性而出現(xiàn)錯(cuò)檢或漏檢。在我國，許龍巖等[5]、蔡亦紅[6]等建立的食品中PCR檢測方法均只能鑒定志賀氏菌屬。并且上述傳統(tǒng)的PCR方法通常選擇侵襲質(zhì)粒（ipaH）基因、O抗原合成基因和16S基因作為目標(biāo)基因，因而檢測通常是基于序列的多態(tài)性或序列差別，而不是基于基因序列的缺失或存在。本研究根據(jù)志賀氏菌獨(dú)特的基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分析，將設(shè)計(jì)的引物用于檢測志賀氏菌屬，同時(shí)對臨床上重要的志賀氏菌（即福氏志賀氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和痢疾志賀氏菌）進(jìn)行區(qū)分。

一個(gè)新的方法在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用之前，必須與得到認(rèn)可的方法進(jìn)行對比，從而得到確證。本研究通過細(xì)菌干擾試驗(yàn)將本室建立的PCR方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法具有相同的檢出水平，但PCR方法更省時(shí)、方便、快捷。

為了提高檢測的靈敏性，在PCR檢測前，增加了增菌步驟。其優(yōu)點(diǎn)在于：使損傷的細(xì)胞得以修復(fù)，使細(xì)胞的數(shù)量增加；稀釋樣品中的抑制劑及死細(xì)胞，從而避免出現(xiàn)假陰性或假陽性，增加檢測的靈敏度，提高檢測的可靠性。

表3 人工污染樣品中志賀氏菌的的檢出情況 單位：份

4 結(jié)論

本研究表明，經(jīng)過增菌之后，直接對增菌肉湯進(jìn)行PCR檢測，在其它雜菌污染輕微的食品中，檢測的靈敏度可達(dá) 1～3 cfu/（25 g·mL-1），即使在有大量雜菌干擾的原奶、生肉和奶粉中，檢測限也分別達(dá)到了≤ 12、27和≤ 27 cfu/（25 g·mL-1）。因此，增菌步驟對提高檢測的靈敏度十分必要。另外，將增菌肉湯劃線接種于固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后對可疑菌落再進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在所有檢樣中均能檢測到志賀氏菌，與GB4789.5的傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測限一致，均達(dá)到了 1～3 cfu/（25 g·mL-1），說明該方法的檢測靈敏度與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相同，可用于樣品中志賀氏菌的常規(guī)檢測分析。

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[5] 許龍巖，李志勇，王志強(qiáng)，等. PCR 方法檢測志賀氏菌的研究[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2003，13（5）：28-29.

[6] 蔡亦紅. PCR 快速檢測食品中志賀氏菌方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（2）：150-153.