楊斐玉，吳新玉，雷丹丹，徐國波，3*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.國家苗藥工程技術(shù)中心及教育部民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用工程研究中心，貴州貴陽 550004)

地烏泡為薔薇科懸鉤子屬植物灰毛泡(RubusirenaeusFocke)的干燥全株，全年均可采集。功能主治：理氣止痛，散毒生肌。用于治療氣滯腹痛、口角炎[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種生物活性[2]。研究報道懸鉤子屬植物多糖具有抗炎、降糖、抗氧化、抗腫瘤等作用[2-5]，如粗葉懸鉤子的根部提取物中總多糖具有減輕炎癥因子對肝細(xì)胞造成損傷的作用[3]；托盤的根多糖具有體外降糖作用[4]以及抗氧化作用[5]。然而該屬藥材地烏泡的化學(xué)成分及其藥理研究報道較少，僅劉戎等[6]對其根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取部分中的化學(xué)成分進行報道。前期研究發(fā)現(xiàn)地烏泡水提醇沉物粗多糖具有抗氧化作用，故采用水提醇沉法考察地烏泡多糖的最佳提取條件，并采用DPPH自由基和ABTS自由基的清除試驗評估其體外抗氧化活性，旨在為充分利用地烏泡藥材資源提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器DRHH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設(shè)備公司)；FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器公司)；BT-3000型電子天平(上海友聲衡器公司)；FA2204B型精密電子天平(上海天美天平儀器公司)；UV-2700型紫外可見分光光度計(島津檢測技術(shù)公司)；PS-40型超聲波清洗器(鞏義市予華儀器公司)；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(購自上海一恒科學(xué)儀器公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(上海予英儀器公司)；多功能酶標(biāo)儀(Biotek，USA)。

1.2材料與試劑地烏泡為灰毛泡(RubusirenaeusFocke)的干燥全株，2017年9月采自貴州省黔東南雷山縣。經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龍慶德副教授鑒定為薔薇科懸鉤子植物灰毛泡。

供試試劑：抗壞血酸(四川依科制藥)；葡萄糖(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué))；無水乙醇、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷、苯酚均為分析純；ABTS[2，2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]、DPPH[2，2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl]均來自美國Sigma公司。

1.3試驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱定在105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖25.0 mg，加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，配制成0.25 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加蒸餾水稀釋至50 mL容量瓶中，搖勻。取稀釋液1.0 mL于20 mL具塞試管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL混勻，靜置，于75 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白同法操作。在紫外-可見分光光度計全波長范圍內(nèi)進行掃描，葡萄糖對照品在490 nm處有最大吸收。在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，所測得的吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得線性回歸方程：A=0.037 5C-0.044 7，R2=0.999 2，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.3.2地烏泡多糖的提取與測定。準(zhǔn)確稱取地烏泡粗粉(過4號篩)10.0 g置于磨口圓底燒瓶中，加熱回流提取，抽濾后減壓濃縮，濃縮液加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為70%，低溫靜置過夜，抽濾得粗多糖沉淀。取10.0 mg粗多糖加蒸餾水溶解，采用Sevage法進行脫蛋白處理，取上清液置于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，經(jīng)分光光度法檢測，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多糖的提取量。

1.3.3正交試驗。參照文獻[7-10]方法，采用水提醇沉法，按照表1條件以提取溫度、料液比、提取時間為3因素提取地烏泡粗多糖，進行L9(33)正交試驗，確定熱水浸提法提取地烏泡多糖的最佳工藝。

表1 試驗設(shè)計因素與水平

1.3.4地烏泡多糖體外抗氧化活性測定。

1.3.4.1地烏泡多糖提取物體外DPPH·的清除能力測定。按照文獻[11]，取10 μL不同濃度的地烏泡多糖溶液，加入290 μL DPPH溶液，暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測吸光值(Ai)。以等體積的無水乙醇代替樣品溶液作樣品空白組(A0)，以等體積樣品溶液代替DPPH溶液作為溶劑空白組(Aj)，平行測定3次。DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100%，以VC作陽性對照。

1.3.4.2地烏泡多糖提取物體外ABTS+·清除能力測定。參照文獻[12]方法，分別取10 μL不同濃度的地烏泡多糖溶液，加入290 μL ABTS溶液，暗處反應(yīng)6 min，在734 nm處測吸光值(Ai)。同時以等體積無水乙醇代替樣品溶液作為樣品空白組(A0)，以等體積樣品溶液代替ABTS溶液作為溶劑空白組(Aj)，平行測定3次。自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100%，以VC作陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1正交試驗結(jié)果由表2可知，當(dāng)?shù)貫跖荻嗵翘崛〉淖罴褩l件組合為A2B2C3時，提取的地烏泡多糖提取量最高。由表3可知，因素C對地烏泡多糖提取的影響最大，因素B對地烏泡多糖提取的影響最??；各因素作用主次順序為C>A>B。其中，因素A和因素C對提取量均有顯著影響(P<0.05)，因素B無顯著性影響(P>0.05)。故地烏泡多糖最佳提取方案：提取溫度80 ℃，料液比1∶15，提取時間3 h。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

按照優(yōu)化工藝進行驗證試驗，平行3次。由表4可知，地烏泡多糖平均提取量為251 μg/g，RSD為1.79%，說明此方案穩(wěn)定，地烏泡多糖提取的最佳工藝為A2B2C3。

表4 驗證試驗結(jié)果

2.2地烏泡多糖體外抗氧化活性測定

2.2.1地烏泡多糖體外DPPH·的清除能力。由圖2可知，地烏泡多糖質(zhì)量濃度從0.031 25 mg/mL到0.250 00 mg/mL對DPPH·清除率從16.30%增大到76.90%，而同質(zhì)量濃度的VC清除DPPH·能力即達96.05%。說明地烏泡多糖具有明顯的清除DPPH·能力。

圖2 多糖和VC對DPPH·的清除率Fig.2 Determination of DPPH free radical by polysaccharide and VC

2.2.2地烏泡多糖體外ABTS+·的清除能力。由圖3可知，在濃度為0.031 25～0.500 00 mg/mL時，地烏泡多糖對ABTS+·的清除作用隨地烏泡多糖濃度的增加而逐步增強，地烏泡多糖對ABTS+·清除率從5.68%增大到74.38%。在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)地烏泡多糖清除率低于VC的清除率。

圖3 多糖和VC對ABTS+·的清除率Fig.3 Determination of ABTS free radical by polysaccharide and VC

3 結(jié)論與討論

采用水提醇沉法提取地烏泡多糖，影響多糖提取的因素為提取時間>提取溫度>料液比。正交試驗設(shè)計確定最佳地烏泡多糖的提取方案：提取溫度80 ℃，料液比1∶15，提取時間3 h。在此工藝條件下進行驗證試驗，得到地烏泡多糖平均提取量為251 μg/g。試驗初步建立地烏泡多糖制備方法，為后續(xù)地烏泡進一步分離純化及活性評價奠定研究基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)對懸鉤子屬植物的研究和利用還比較少，大都是調(diào)查資源分布情況[13]。通過地烏泡多糖對DPPH·和ABTS+·的清除能力研究其抗氧化能力，結(jié)果顯示地烏泡多糖濃度與自由基清除率間呈正相關(guān)。地烏泡多糖具有很好的抗氧化能力，該試驗為地烏泡多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

[1] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽：貴州科技出版社，2003：52.

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[13] 劉勝貴，李路，左清清，等.懸鉤子屬植物提取物的抑菌效果及抗氧化性研究[J].北方園藝，2014(6)：128-131.

名詞解釋

擴展總被引頻次：指該期刊自創(chuàng)刊以來所登載的全部論文在統(tǒng)計當(dāng)年被引用的總次數(shù)。這是一個非?？陀^實際的評價指標(biāo)，可以顯示該期刊被使用和受重視的程度，以及在科學(xué)交流中的作用和地位。

擴展影響因子：這是一個國際上通行的期刊評價指標(biāo)，是E·加菲爾德于1972年提出的。由于它是一個相對統(tǒng)計量，所以可公平地評價和處理各類期刊。通常，期刊影響因子越大，它的學(xué)術(shù)影響力和作用也越大。具體算法為：

擴展即年指標(biāo)：這是一個表征期刊即時反應(yīng)速率的指標(biāo)，主要描述期刊當(dāng)年發(fā)表的論文在當(dāng)年被引用的情況。具體算法為：

擴展他引率：指該期刊全部被引次數(shù)中，被其他刊引用次數(shù)所占的比例。具體算法為：

擴展引用刊數(shù)：引用被評價期刊的期刊數(shù)，反映被評價期刊被使用的范圍。