李 陽， 陸晨暉， 陸驪工， 張海軍， 滕皋軍， 李茂全

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院介入血管外科,上海 200072； 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院介入血管研究所，上海 200072)

內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)具有誘導(dǎo)血管新生，重建缺血區(qū)域微循環(huán)功能的作用，在治療下肢缺血的臨床研究中已經(jīng)取得了明確的療效[1-2]。糖尿病患者自體EPCs在高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激下出現(xiàn)功能障礙，需要進(jìn)行干預(yù)調(diào)控才能有效提高其促糖尿病足微循環(huán)血管新生的療效。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)是一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、遷移及分化的多效活性肽，可以促進(jìn)血管生成、傷口愈合、胚胎發(fā)育和器官分化[3]，然而FGF2對(duì)高糖下EPCs功能障礙的修復(fù)作用尚未有人研究。因此，本研究主要探討外源FGF2對(duì)體外高糖條件下受損EPCs功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠26只，每只體質(zhì)量約25g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)在SPF級(jí)、12h晝夜循環(huán)的動(dòng)物房，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

EGM2培養(yǎng)液購自Cloneties公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA購自北京雷根生物有限公司；FGF-2購自R&D公司；TUNEL工作液購自Roche公司;基質(zhì)膠購自Becton Dickson公司；單克隆抗體CD31、CD144、CD45、KDR及兔抗小鼠active β-catenin、β-catenin多克隆抗體購自Abcam公司；FITC標(biāo)記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自Sigma公司；DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)購自Molecular Probes公司；0.25%胰酶購自美國Invitrogen公司；多聚甲醛、RIPA裂解液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；IgG山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL熒光顯示劑購自Pirece公司；其余為市售試劑(級(jí)別： AR)。

儀器24孔板、Transwell小室購自美國Corning公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus；凝膠圖像分析軟件購自上海天能科技有限公司；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀和酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thremo公司；激光多普勒血流儀購自美國Devon公司。

1.2 EPCs的分離培養(yǎng)與鑒定

小鼠使用巴比妥酸麻醉后斷頸處死，無菌條件下從股骨和脛骨取骨髓組織，分離單核細(xì)胞。使用EGM2培養(yǎng)液補(bǔ)充VEGF等生長(zhǎng)因子和5%胎牛血清培養(yǎng)，取貼壁細(xì)胞繼續(xù)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液1次。流式細(xì)胞儀分析EPCs細(xì)胞表型以及Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I雙熒光染色鑒定EPCs。

1.3 EPCs分組及處理

EPCs培養(yǎng)7d后，以0.25%胰酶消化，細(xì)胞懸液以1×106/mL接種，分為正常對(duì)照組、高糖組、高糖+FGF-2處理組，培養(yǎng)48h后，進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)。正常對(duì)照組采用EGM2培養(yǎng)液+5%胎牛血清培養(yǎng)，高糖組采用EGM2培養(yǎng)液+5%胎牛血清+高糖(30mmol/L)培養(yǎng)，高糖+FGF-2處理組采用EGM2培養(yǎng)液+5%胎牛血清+高糖(30mmol/L)+FGF-2(0、30、50、100、150、300ng/mL)。

1.4 EPCs凋亡檢測(cè)

按TUNEL法標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，蒸餾水洗后，按照試劑盒說明進(jìn)行，避光條件下DAB顯色，用蘇木精復(fù)染、中性樹膠封片，高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.5 EPCs遷移能力

采用Transwell小室評(píng)價(jià)EPCs的遷移能力。將同步化后的EPCs用2.5g/L胰酶消化，用無血清的M199培養(yǎng)基重懸后，以2×104/孔的密度重新種植于24孔板Transwell的上室，下室加入含50μg/L VEGF的培養(yǎng)基，將FGF2加于上室。CO2孵箱孵育24h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)6個(gè)隨機(jī)視野的EPCs數(shù)量。

1.6 EPCs成管能力檢測(cè)

將稀釋的基質(zhì)膠按200μL/孔接種到預(yù)冷的24孔板中，置于37℃ 40min，使基質(zhì)膠凝固。消化收集細(xì)胞，用EGM-2懸浮，每孔按2×104/500μL加入24孔板中，37℃ 5%CO2孵育24h。倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)小管樣結(jié)構(gòu)。

1.7 Western印跡法檢測(cè)活化β-catenin和總β-catenin的表達(dá)

EPCs細(xì)胞培養(yǎng)7d后，以0.25%胰酶消化，細(xì)胞懸液以1×106/mL接種，各處理?xiàng)l件下培養(yǎng)48h后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取20μg蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用相應(yīng)抗體孵育后，化學(xué)發(fā)光法ECL顯影。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)各特異性條帶進(jìn)行累計(jì)吸光密度分析。

1.8 體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠構(gòu)建后肢缺血模型，步驟如下： 適量戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉，脫毛劑脫除小鼠雙下肢全部毛發(fā)。仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒，鋪巾，從腹股溝到膝關(guān)節(jié)處沿著血管走向用眼科剪剪開一縱形切口，暴露股動(dòng)脈全長(zhǎng)，上端結(jié)扎股動(dòng)脈出腹股溝處并切斷，向下逐一結(jié)扎切斷分支動(dòng)脈至股動(dòng)脈分支為腘動(dòng)脈和股淺動(dòng)脈處，取出股動(dòng)脈，逐層縫合皮膚。丁丙諾啡(0.04mg/kg SC)被用來術(shù)后鎮(zhèn)痛。將后肢缺血小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。收集正常組、高糖組、高糖+FGF2(150ng/mL)組EPCs，在后肢缺血模型建立后48h，通過小鼠尾靜脈注射1×107個(gè)各處理下EPCs，其中1組注射無細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。EPCs注射4周后，利用激光多普勒血流儀測(cè)量小鼠后肢血液灌注情況。紅色區(qū)域?yàn)檠汗嘧⒇S富的區(qū)域。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EPCs培養(yǎng)與鑒定

EPCs傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，呈卵圓形生長(zhǎng)，見圖1A、圖1B。激光共聚焦顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞，在激發(fā)光549nm，發(fā)射光565nm波長(zhǎng)時(shí)，DiI-Ac-LDL吞噬功能呈陽性，細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色，見圖1C；在激發(fā)光488nm，發(fā)射光520nm波長(zhǎng)下細(xì)胞與FITC-UEA-1結(jié)合，連接呈陽性，呈現(xiàn)綠色熒光，見圖1D。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，EPCs相關(guān)的表面抗原標(biāo)記KDR、CD31、CD144陽性率分別為(95.2±4.1)%、(84.1±6.8)%和(77.5±7.8)%；不表達(dá)造血干細(xì)胞系表面抗原標(biāo)記CD45，其陽性率僅為(4.9±1.2)%，見圖1E。

2.2 FGF2對(duì)高糖下EPCs凋亡的影響

Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，EPCs與高糖共同孵育48h后，細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；不同濃度外源性FGF-2處理下的EPCs，細(xì)胞凋亡率較高糖組明顯降低，且凋亡率隨FGF2濃度的升高逐漸降低，150ng/mL FGF2處理組凋亡率降低最為明顯(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀與激光共聚焦顯微鏡對(duì)EPCs鑒定結(jié)果(×200，n=3)Fig.1 Identification of EPCs by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy(×200，n=3)

圖2 Tunel檢測(cè)EPCs凋亡率Fig.2 Apoptosis rate of EPCs與對(duì)照組相比，*P<0.01；與高糖組相比，#P<0.05,##P<0.01;n=3

2.3 FGF2對(duì)高糖下EPCs遷移的影響

Tranwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組EPCs遷移數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；不同濃度外源性FGF-2處理的高糖損傷后EPCs，細(xì)胞遷移數(shù)均顯著高于高糖組(P<0.05)，且細(xì)胞遷移數(shù)隨FGF2濃度的升高依次增多，150ng/mL FGF2處理組細(xì)胞遷移數(shù)增加最為顯著(P<0.01)，見圖3。

圖3 Transwell檢測(cè)EPCs遷移圖像及遷移率(×200)Fig.3 EPCs cell migration in Transwell chamber(×200)與對(duì)照組相比，*P<0.01；與高糖組相比，#P<0.05,##P<0.01;n=3

2.4 FGF2對(duì)高糖下EPCs成管能力的影響

細(xì)胞成管檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組EPCs成管腔數(shù)目較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，外源性FGF-2的加入顯著提高了細(xì)胞成管能力(P<0.05)，且隨FGF2濃度的升高細(xì)胞成管腔數(shù)目依次增多，加入150ng/mL FGF2處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞成管能力最強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，見圖4。

圖4 EPCs的Matrigel成管圖像及成管率(×200)Fig.4 Tube formation of EPCs in Matrigel(×200)與對(duì)照組相比，*P<0.01；與高糖組相比，#P<0.05,##P<0.01;n=3

2.5 FGF2對(duì)高糖下EPCs Wnt/β-catenin通路活化的影響

Western印跡法結(jié)果表明，高糖組EPCs中活性β-catenin的比例較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，外源性FGF-2的加入顯著提高了活性β-catenin的比例(P<0.05)，且隨FGF2濃度的升高逐漸增加，150ng/mL濃度下β-catenin活性最強(qiáng)(P<0.01)，見圖5。

2.6 體內(nèi)驗(yàn)證FGF2對(duì)高糖下EPCs功能的影響

激光多普勒血流儀測(cè)量結(jié)果顯示，4周后，注射正常EPCs的小鼠缺血后肢血流量顯著增加，注射高糖處理EPCs的小鼠缺血后肢血流量較正常EPCs組顯著降低，而高糖+FGF2組小鼠缺血后肢血流量較高糖EPCs組顯著升高，見圖5。

圖5 EPCs中Wnt/β-catenin通路信號(hào)分子的表達(dá)Fig.5 Expression of Wnt/β-catenin signaling molecules in EPCs與對(duì)照組相比，*P<0.01；與高糖組相比，#P<0.05,##P<0.01;n=3

圖6 激光多普勒血流儀測(cè)量各組小鼠缺血后肢血流量(n=6)Fig.6 Blood flow of mouse ischemic hindlimb measured by laser Doppler flowmetry(n=6)

3 討 論

糖尿病可引發(fā)多種并發(fā)癥[4]。糖尿病足是指糖尿病患者因合并神經(jīng)病變和末梢血管病變(下肢動(dòng)脈供血不足)而引起下肢皮膚潰瘍、感染和(或)深部組織破壞等病變，許多患者因此截肢致殘[5]。微循環(huán)障礙是糖尿病足的重要病理基礎(chǔ)，它在糖尿病患者血管內(nèi)皮功能障礙及植物神經(jīng)調(diào)節(jié)功能障礙的共同長(zhǎng)期作用下形成，導(dǎo)致組織缺血[6]。缺血組織釋放的因子能動(dòng)員并招募干細(xì)胞、前體細(xì)胞至損傷部位并替換修復(fù)損傷組織[7]。

血管生成是一個(gè)多階段的過程，涉及多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及細(xì)胞的參與[8]。EPCs具有增殖、黏附、遷移并形成特定血管結(jié)構(gòu)的能力[9]。利用EPCs能夠移行至血管受損部位進(jìn)行修復(fù)的特點(diǎn)[10]，將EPCs移植到缺血組織可以作為治療血管相關(guān)疾病的一種很有前途的方法[11]。自體EPCs移植有患者痛苦小、采集的干細(xì)胞數(shù)量多、移植后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)[12]，然而，在糖尿病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境下，自體EPCs移植因?yàn)镋PCs功能障礙而收效甚微，對(duì)其進(jìn)行人工干預(yù)有望改善自體EPCs功能。

EPCs最早從人的外周血液中分離獲得，細(xì)胞表面抗原CD34+和KDR+為標(biāo)志。在缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)其能在組織水平上整合到新生毛細(xì)血管，從而提示EPCs能增進(jìn)缺血組織的血管側(cè)支生長(zhǎng)[13-14]。EPCs共表達(dá)兩種表面標(biāo)志物，即造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物(CD34和CD133)和內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物(VEGF-R2，亦稱KDR)[15]。早期EPCs生長(zhǎng)速度較快，具有高血管生成能力，但增殖能力較低，表達(dá)髓系[16]。晚期EPCs生長(zhǎng)速度較慢，是高度增殖非髓樣細(xì)胞，形成內(nèi)皮細(xì)胞[17-18]。在一些CD分子的表達(dá)上，Late EPCs幾乎不表達(dá)CD133，KDR和CD34表達(dá)量不高[19]，幾乎100%表達(dá)CD31、CD144、CD146、CD105、vWF和Enos。流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離的EPCs表達(dá)與內(nèi)皮祖細(xì)胞系相關(guān)的表面抗原標(biāo)記KDR、CD31、CD144，而不表達(dá)造血干細(xì)胞系表面抗原標(biāo)記CD45。培養(yǎng)至第7天，貼壁的梭形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)邊緣出芽生長(zhǎng)，表達(dá)EPCs特異性抗原標(biāo)志，可特異性攝取FITC-UEA-I并內(nèi)吞Dil-ac-LDL，確定細(xì)胞為晚期內(nèi)皮組細(xì)胞。

EPCs能分泌包括VEGF、HGF、MCP-1、IL-1β、IL-8等多種生長(zhǎng)因子，但EPCs自分泌或者旁分泌的FGF-2數(shù)量極低。高糖會(huì)導(dǎo)致EPCs的這種旁分泌與自分泌功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者EPCs分泌的干細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和促血小板生成素減少，而IL-1β、TNF-α增加，低氧環(huán)境不能上調(diào)其HIF-1α表達(dá)。高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病患者EPCs功能障礙的主要原因[20]，氧化應(yīng)激可促進(jìn)EPCs凋亡[21]，并引起EPCs活性降低，遷移、成管等功能下降[22]。因此，氧化應(yīng)激可能是預(yù)防糖尿病血管穩(wěn)態(tài)受損的重要治療靶點(diǎn)。本研究通過在體外模擬糖尿病體內(nèi)高糖環(huán)境，結(jié)果表明30mmol/L高糖培養(yǎng)條件下EPCs凋亡增加，遷移和成管能力明顯下降，說明高糖導(dǎo)致了EPCs功能障礙。FGF2在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，通過刺激蛋白酶合成金屬蛋白酶和尿激酶型纖溶酶原激活劑，降解基底膜，有助于細(xì)胞遷移形成新血管[23]；參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)新生血管的成熟[24]；可刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的合成[25]，這些都表明FGF-2具有促血管生成特性。體內(nèi)FGF2參與增殖、分化、血管生成、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育與分化為多器官等重要生理過程。本研究通過加入外源FGF-2，研究其對(duì)EPCs功能障礙的修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入外源性FGF-2可顯著抑制高糖引起的EPCs凋亡，遷移和成管能力也明顯增強(qiáng)，濃度為150ng/mL時(shí)效果最好；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)GF-2處理過的高糖-EPCs對(duì)缺血修復(fù)作用也顯著提高，進(jìn)一步表明FGF-2可以明顯改善高糖引起的EPCs功能障礙。Wnt信號(hào)是已知的調(diào)節(jié)血管生成和調(diào)整EPCs動(dòng)員的關(guān)鍵。有研究[26]表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在血管生物學(xué)中起關(guān)鍵的作用，激活Wnt信號(hào)通路能促進(jìn)肢體缺血損傷后的血管再生，而抑制Wnt信號(hào)通路則起相反作用。FGF-2是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)EPCs的功能有待研究，本研究發(fā)現(xiàn)FGF-2加入后Wnt/β-catenin通路活化，表明，F(xiàn)GF2是通過激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)受損EPCs功能恢復(fù)。

分離糖尿病患者EPCs，在體外用高水平的FGF-2處理改善其功能，再用于自體EPCs移植，有利于提高自體細(xì)胞移植療效，使其更加有效地促進(jìn)血管發(fā)生、參與傷口愈合。因此，注射外源性FGF-2處理的自體EPCs有可能提高EPCs治療的受益程度和預(yù)防截肢。但目前EPCs治療尚未形成一套標(biāo)準(zhǔn)的表型和功能分析，亦未對(duì)細(xì)胞體內(nèi)環(huán)外境的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化，在EPCs生物學(xué)的研究中仍然存在的爭(zhēng)議很多。

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