陳東霞，張力，李曉霞，樸金花，梁振興，姜建國

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州 510640）

甘油的催化氧化是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系，包括多個(gè)平行和串聯(lián)反應(yīng)，可以生成甘油醛和甘油酸等多種產(chǎn)物[4]。通常的甘油催化氧化技術(shù)耗時(shí)昂貴且復(fù)雜繁瑣，并且缺乏足夠的特異性。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道Pt、Pd和Au納米顆粒作為電催化劑在助劑的作用下可以選擇性催化氧化甘油[3,5～7]，但催化劑/產(chǎn)物分離過程復(fù)雜，貴金屬催化劑重復(fù)使用困難，在各種替代技術(shù)中，酶由于其具有專一性、高選擇性和高效率，表現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景[8]。

很多研究團(tuán)隊(duì)用酶作為催化進(jìn)行了甘油的催化氧化研究，Minteer[2,9～11]報(bào)道了在聚合物基底上使用多壁碳納米管和其修飾的金納米顆粒作為酶電極的修飾材料，制備 PQQ固定的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶修飾電極，在其上進(jìn)行多步氧化過程以將甘油氧化成丙酮二酸，電流密度高達(dá) 16.8±2.1 μA/cm2；Fernando[12]通過采用無機(jī)硫化鐵單分子線修飾的金電極支撐NAD+-甘油脫氫酶輔酶配合物，制備了甘油氧化生物傳感器，其甘油選擇性氧化集中在生物轉(zhuǎn)化上，用甘油脫氫酶催化產(chǎn)生 1,3-二羥基丙酮[13,14]；Michelle[15]開發(fā)了基于甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶的電化學(xué)方法，通過鉑微電極測(cè)定生物柴油樣品中的游離甘油。

對(duì)于酶催化劑，酶的活性位點(diǎn)到電極表面的電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制通常被分類為直接電子轉(zhuǎn)移（DET）和間接電子轉(zhuǎn)移（MET）。而在各種氧化還原酶中少于10%被證明可以通過 DET機(jī)制進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移[16]，大多數(shù)氧化研究依賴于外源氧化還原電對(duì)（可溶性氧化還原物質(zhì)，還原性初級(jí)代謝物或外膜氧化還原蛋白），促進(jìn)電子從酶活性位點(diǎn)轉(zhuǎn)移，提高整體生物電化學(xué)效率。由于聚吡咯良好的環(huán)境穩(wěn)定性，離子交換性能和高導(dǎo)電性，其納米復(fù)合材料被廣泛應(yīng)用于超級(jí)電容器，氣體檢測(cè)機(jī)理和吸附劑[17～19]，如聚吡咯及其改性物質(zhì)如石墨烯-聚吡咯納米復(fù)合材料被認(rèn)為是從廢水中去除ClO4-的有效吸附劑[20]。基于聚吡咯-石墨烯的納米復(fù)合材料在酶修飾電極的制備中也可以預(yù)期去的很好的效果。

本論文研究了一種用于甘油催化氧化的新型酶電極。所構(gòu)建的甘油酶電極以甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶為催化劑，以三維石墨烯為載體，以聚吡咯為介體，同時(shí)采用Nafion溶液作為粘結(jié)劑，固定的修飾層在酶、介體及電極表面提供良好的電子轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石墨粉（99.0%，天津市大茂化學(xué)試劑廠），甘油（99.0%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司），甘油激酶（25～75 U/mg，Sigma），甘油三磷酸氧化酶（≥70 U/mg，Sigma），吡咯（99.0%，Adamas-beta），Nafion（5 wt%，Dupont D-520，昆山桑萊特新能源科技有限公司），鐵氰化鉀（99.9%，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。其他常規(guī)試劑均來自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（Zeiss Merlin，德國）；冷凍干燥機(jī)（ALPHA1-4LD plus，德國CHRIST）；電化學(xué)工作站（CHI660E，上海辰華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9076A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300VDB，昆山市超聲儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050，上海秣馬恒溫設(shè)備廠）；酸度測(cè)定儀（pH 400，Alalis）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 三維石墨烯的制備

采用改進(jìn)的 Hurnmers方法制備氧化石墨[21]，取100 mg氧化石墨于燒杯中，加入50 mL去離子水后超聲剝離 2 h，之后取分散液移到高壓反應(yīng)釜中，在180 ℃條件下水熱還原16 h后取出，冷凍干燥24 h。

由表12可以看出隨著浴比的減小，棉條表觀深度K/S值增加，在浴比1：10棉條得色最深，但是染色不勻。這是由于浴比減小，上染率越大，棉條得色越深，但浴比過小，容易染色不勻。所以宜選擇浴比1：15，以獲得良好的染色深度。

1.3.2 吡咯的聚合

將工作電極的表面依次用直徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，再用水沖洗；然后依次在無水乙醇和水中超聲清洗 1 min，取出用水洗凈，晾干。將吡咯單體（經(jīng)70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)預(yù)處理2 h）配制成為0.1 mol/L的吡咯溶液（含0.1 mol/L的LiClO4）；采用循環(huán)伏安法（聚合電位：-1.0～1.0 V，掃速：50 mV/s）在10 mL吡咯溶液中電化學(xué)聚合不同時(shí)間，即可在電極表面得到不同厚度的聚吡咯膜，在室溫下晾干，得到聚吡咯膜修飾的電極。

1.3.3 酶電極的制備

圖1 聚吡咯酶修飾電極反應(yīng)過程示意圖Fig.1 The schematic diagram of the fabrication of the PPy-modified enzymatic electrode

將三維石墨烯溶液超聲 2 h后得到濃度為 1 mg/mL分散液，采用0.1 mol/L NaOH溶液將5 wt%Nafion溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，將甘油激酶和甘油3-磷酸氧化酶分別配制成濃度為30 mg/mL的水溶液，將四種溶液以1:1:1:1體積比混合得到混合溶液，取6.7 μL混合溶液滴于有聚吡咯膜的電極表面，在室溫下晾干，得到催化甘油的酶電極。所述酶電極的修飾過程如圖1所示。

1.3.4 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試采用經(jīng)典三電極體系，工作電極為在玻碳電極基底上制備的酶修飾電極，對(duì)電極為鉑片電極，參比電極為銀/氯化銀電極。在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中進(jìn)行不同聚合圈數(shù)制備的聚吡咯膜性能測(cè)試，采用循環(huán)伏安法在0～0.5 V范圍內(nèi)測(cè)試。將所得基于催化甘油的酶電極在室溫下進(jìn)行電化學(xué)性能測(cè)試，均在 10 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.0）中進(jìn)行，測(cè)試之前通N2，測(cè)試過程中采用循環(huán)伏安法，其中空白對(duì)照未滴加甘油，測(cè)試穩(wěn)定后滴加100 μL甘油。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚吡咯的制備及表征

圖2 不同聚合圈數(shù)的聚吡咯的SEMFig.2 SEM images of PPy films of different cycles

通過在電極上生長不同數(shù)量的吡咯聚合物，制備具有不同膜厚度的電極。采用掃描電子顯微鏡對(duì)所制備的PPy修飾電極的微觀結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了研究，其掃描電子顯微鏡圖如圖2所示，結(jié)果表明，吡咯明顯在電極表面聚合，顯示出西蘭花狀結(jié)構(gòu)，并隨著聚合圈數(shù)從2圈增加到16圈，其膜厚度增加，當(dāng)聚合圈數(shù)為16時(shí)其尺寸大于1 μm。

將不同修飾電極（GCE/PPy/PPy-GN-GK-GPO電極）在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試（掃描電位 0～0.5 V，掃描速度50 mV/s），其循環(huán)伏安圖如圖3所示，結(jié)果表明，在裸電極和修飾電極上都可以明顯觀察到Fe2+/Fe3+的一對(duì)可逆的氧化還原峰。裸電極的峰值電流（42.97 μA）與酶修飾電極的峰值電流（196.7 μA）相比最低，而PPy修飾電極的峰值電流較高，達(dá)到204.5 μA，這可能是由于酶的絕緣蛋白層阻礙了電子轉(zhuǎn)移。同時(shí)從圖3可知，隨著聚吡咯薄膜的增加，電流穩(wěn)定增加，并且與同時(shí)添加酶和石墨烯表現(xiàn)出相似的行為，則聚吡咯膜可能形成用于酶固定的致密結(jié)構(gòu)，并同時(shí)作為電子轉(zhuǎn)移的橋梁有助于電子轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果證實(shí)催化甘油的酶電極已成功制備。

圖3 不同電極在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 The CVs of different electrodes in ferricyanide solution

2.2 酶濃度對(duì)催化電流的影響

實(shí)驗(yàn)研究了不同酶濃度對(duì)催化電流的影響，當(dāng)GK和GPO的濃度為30 mg/mL時(shí)，催化電流為49.54 μA，當(dāng)濃度達(dá)到60 mg/mL時(shí)，催化電流下降到42.73 μA，說明酶濃度的增加使得酶層變厚，可能降低電極的靈敏度，限制了電極表面介體與電子的傳輸與轉(zhuǎn)移。

酶電極通過GN和GK/GPO形成穩(wěn)定的鍵，因此可以利用復(fù)合材料來提高甘油檢測(cè)的靈敏度和選擇性。在進(jìn)一步研究中，GK和GPO的濃度為30 mg/mL，且GK和GPO的比例固定為1:1。

2.3 主要實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖4 PPy-GN-GK-GPO修飾電極在不同pH 的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液中的電流響應(yīng)（甘油添加量為0.99 mmol/L）Fig.4 Amperometric response of the PPy-GN-GK-GPO modified electrode containing 0.99 mmol/L glycerol in0.2 mol/L PBS of different pHs

pH的變化不僅影響酶的活性，而且可能改變酶修飾電極表面的電荷性質(zhì)。不同pH對(duì)PPy-GN-GK-GPO電極性能的影響（甘油添加量為0.99 mmol/L）如圖4所示，催化電流峰值在pH為7.0是最大的，與應(yīng)用于甘油三酸酯測(cè)定的多酶類型生物傳感器中的結(jié)果一致[22]，表明酶在該pH下更具活性，固定化的GK/GPO保持其天然結(jié)構(gòu)并且不變性。同時(shí)由圖4可知，催化電流在弱酸性溶液（pH 5.0和pH 6.0）中略有下降，而在弱堿性pH（pH 8.0和pH 9.0）下急劇下降，這可能是由于酶從電極表面的失活或浸出引起。在甘油氧化的相關(guān)研究中，Mahadevan[12]報(bào)道在Tris緩沖液中的最佳pH為10，Pundir[23]報(bào)道在0.1 mol/L PBS中的最佳pH為6.5。pH的差異會(huì)影響各種聚合物和固定物質(zhì)的相互作用，同時(shí)在酶活性位置的環(huán)境中的變化可能導(dǎo)致酶和固定物質(zhì)之間的不同相互作用。

2.4 修飾電極的電化學(xué)性能

通過循環(huán)伏安法以不同掃速對(duì) PPy-GN-GK-GPO電極進(jìn)行了電化學(xué)測(cè)試，結(jié)果如圖5所示，其中甘油添加量為1.95 mmol/L。由圖5可知，在約-0.6 V至-0.4 V的范圍內(nèi)出現(xiàn)了可逆的氧化還原對(duì)，這歸結(jié)于固定在電極上的聚吡咯的穩(wěn)定的氧化還原反應(yīng)。同時(shí)，隨著掃描速率從50 mV/s增加到300 mV/s，氧化還原電流和電位差都增加，氧化峰/還原峰電位逐漸轉(zhuǎn)移到正/負(fù)電位，并且峰電流的數(shù)值與掃描速率的平方根成線性相關(guān)。這表明該復(fù)合修飾電極的氧化還原過程是準(zhǔn)可逆的，且該反應(yīng)過程主要為擴(kuò)散控制而不是表面電化學(xué)過程控制。

圖5 （a）PPy-GN-GK-GPO修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖（甘油添加量為1.95 mmol/L）；（b）電流與掃速的平方根之間的線性關(guān)系圖Fig.5 (a) The CVs of PPy-GN-GK-GPO modified electrode at different scan rates in 0.2 mol/L PBS containing 1.95 mmol/L glycerol; (b) The linear equations between peak current and the square root of scan rate

2.5 修飾電極的電催化性能

圖6 PPy-GN-GK-GPO修飾電極在0.2 mol/L磷酸緩沖溶液中對(duì)甘油的電流響應(yīng)圖Fig.6 The CVs of PPy-GN-GK-GPO modified electrode in 0.2 mol/L PBS with/without glycerol

修飾電極在磷酸緩沖溶液中的電催化性能如圖 6所示，其中曲線分別為未添加甘油、甘油添加量為0.99 mmol/L、甘油添加量為 1.95 mmol/L。PPy-GNGK-GPO修飾電極顯示出準(zhǔn)可逆行為，且隨著甘油濃度的增加，氧化電流增加，還原電流減低，揭示了PPy-GN-GK-GPO電極對(duì)甘油的強(qiáng)響應(yīng)，說明實(shí)現(xiàn)了甘油的催化氧化。且氧化峰催化電流達(dá)到46.2 μA，電流密度達(dá)到677.6 μA/cm2。根據(jù)上述結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)建立了對(duì)甘油的高響應(yīng)系統(tǒng)。

2.6 修飾電極的穩(wěn)定性

圖7 PPy-GN-GK-GPO修飾電極的連續(xù)響應(yīng)測(cè)試圖Fig.7 Amperometric response of the PPy-GN-GK-GPO modified electrode with continuous tests

將甘油添加量固定為1.95 mmol/L，對(duì)制備的酶修飾電極進(jìn)行連續(xù)的響應(yīng)測(cè)試來評(píng)估PPy-GN-GK-GPO電極的長期穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，在50次循環(huán)后，其電流響應(yīng)為原始反應(yīng)的82.3%，表明該修飾電極電極表面的催化劑層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無明顯形態(tài)變化，具良好的長期連續(xù)穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本論文研究了一種新型的用于甘油催化氧化的酶電極，以甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶為催化劑，采用循環(huán)伏安法將聚吡咯薄膜固定在電極表面，將Nafion、酶與石墨烯混合并固定于電極表面。所述的基于聚吡咯/石墨烯的甘油酶電極在pH為7.0，濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液對(duì)甘油有著較高的電流響應(yīng)，其催化電流達(dá) 46.2 μA，電流密度達(dá) 677.6 μA/cm2。

本文結(jié)合聚吡咯和石墨烯的獨(dú)特性質(zhì)，提高了修飾電極的導(dǎo)電性，并增強(qiáng)了電極表面與分析物之間的電子轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)了甘油的催化氧化，該修飾電極在電化學(xué)催化和生物傳感中有極大的應(yīng)用前景。

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