朱琳，高鳳，曾椿淋，俞冰倩，徐琴，劉軼斐，李雪，魏巍

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

泡菜是我國傳統(tǒng)民間食品，因風(fēng)味和口感獨(dú)特、營養(yǎng)豐富等特征深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。傳統(tǒng)的泡菜制備過程是利用蔬菜附著的微生物或添加乳酸菌進(jìn)行的自然發(fā)酵過程[2]。因此，對(duì)泡菜發(fā)酵過程相關(guān)微生物的研究有助于更好地利用和發(fā)展泡菜資源。通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，一些泡菜發(fā)酵過程中的關(guān)鍵微生物種類得到解析，包括明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌（Weissella）等[3～6]。這些微生物均屬于乳酸菌，對(duì)泡菜中有機(jī)酸的產(chǎn)生至關(guān)重要，是泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢的細(xì)菌類群。近年來新一代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，為泡菜發(fā)酵相關(guān)微生物群落的深度研究提供了新方法[7]，也因此發(fā)現(xiàn)在泡菜的腌制過程中除了上述乳酸菌外的其他一些非乳酸菌菌群，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和擬桿菌屬（Bacteroides）等[8]。這些非乳酸菌細(xì)菌在自然界氮素循環(huán)過程中，尤其是反硝化過程中（硝酸鹽→亞硝酸鹽→一氧化氮）發(fā)揮著重要的作用[9,10]。因此，就產(chǎn)生了泡菜發(fā)酵過程中的非乳酸菌細(xì)菌類群可能與泡菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生和降解密切相關(guān)這樣一種推測，解析泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌和非乳酸菌菌群就具有重要意義。

蘿卜泡菜制作成本低廉、口感爽脆、富含維C以及鋅，有助于提高食欲，促進(jìn)消化，是泡菜企業(yè)生產(chǎn)的主要品種[11,12]。然而，蘿卜泡菜發(fā)酵過程中微生物群落的演替變化以及微生物群落與亞硝酸鹽形成和降解的關(guān)系并不明確。本文運(yùn)用新一代基于Illumina平臺(tái)的高通量測序技術(shù)，以細(xì)菌16S rDNA序列的V4可變區(qū)為靶序列，研究了蘿卜泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的高峰期和回落期發(fā)酵液中細(xì)菌落結(jié)構(gòu)組成，以揭示蘿卜泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的多樣性，探討細(xì)菌群落演替過程和亞硝酸濃度變化之間的關(guān)系，為深入對(duì)研究泡菜發(fā)酵過程中微生物的功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品制備和采集

白蘿卜、食鹽、花椒、辣椒、生姜和泡菜壇等購自本地農(nóng)貿(mào)市場；采用傳統(tǒng)腌制方法制備蘿卜泡菜，共腌制9 d。每天使用一次性移液管在泡菜中間發(fā)酵層隨機(jī)選取3個(gè)位置，吸取發(fā)酵液各2 mL，進(jìn)行12000 r/min的離心處理1 min后得到發(fā)酵液上清液和菌體沉淀。上清液用來立即進(jìn)行亞硝酸濃度和pH測定。而菌體沉淀用于微生物基因組DNA的提取。

1.2 亞硝酸濃度測定

首先制備亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取 20 μM亞硝酸鈉溶液0、0.2、0.5、1.0和2.0 mL，分別置于15 mL離心管中，各加超純水2、1.8、1.5、1.0和0 mL，制備成0、2、5、10和20 μM的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品。取磺胺1 g和鹽酸10 mL，加超純水制成100 mL的試劑1。取N-1-氨基-乙二胺二鹽酸鹽0.1 g溶于100 mL水制成試劑2。取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品2 mL與40 μL的試劑1混合靜置4 min，再加入40 μL的試劑2，混合避光靜置30 min。于波長540 nm處測定亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.3 DNA提取

選擇蘿卜發(fā)酵亞硝酸鹽第3 d（峰值期）和第7 d（回落期）的菌體沉淀進(jìn)行微生物基因組DNA的提取。應(yīng)用Mobio公司的Power Food Microbial DNA Isolation Kit進(jìn)行發(fā)酵液微生物基因組DNA的提取。提取后的、對(duì)應(yīng)3個(gè)位置的微生物基因組DNA進(jìn)行充分混合后，應(yīng)用Nanodrop one進(jìn)行濃度的測定。兩樣品的DNA濃度分別為236 ng/μL和195 ng/μL。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測序

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。以通用引物 515F（ 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[14]為基礎(chǔ)，附加Barcode序列[14]后對(duì)2個(gè)時(shí)期發(fā)酵液處理中細(xì)菌16S rRNA的 V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增均采用Takara試劑公司的HS Taq酶進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢查擴(kuò)增效果。最后將樣品的PCR產(chǎn)物送至北京諾禾至源科技有限公司，在Illumina-HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)高通量測序初始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，以獲得更為精準(zhǔn)、高質(zhì)量的DNA序列信息，采用Mothur軟件將得到的 16S rDNA基因序列在 RDP（ribosomal database project）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)，充分去除嵌合體序列[15]。為了得到每個(gè)操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，out）對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的操作分類單元（OTU）代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，用Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線[16,17]。利用QIIME軟件計(jì)算樣品Chao1豐富度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和 impson多樣性指數(shù)[18]。其中群落豐富度指數(shù)，其值越高表明群落物種的豐富度越高；而多樣性指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，其值越大表明樣品群落多樣性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜泡菜亞硝酸鹽含量和pH的動(dòng)態(tài)變化

蘿卜泡菜在發(fā)酵3 d時(shí)，發(fā)酵液中亞硝酸鹽濃度達(dá)到了峰值，顯著高于起始濃度（p<0.05），且超過了國標(biāo)（GB 2762-2005）規(guī)定的20 mg/kg。然后迅速下降，并在7 d時(shí)降落接近背景值范圍。同時(shí)，pH值從第1 d起由6.5逐漸下降，第3 d時(shí)顯著下降至4.8（p<0.05），并在7 d開始保持在3.8左右，顯著低于起始濃度（p<0.05）。因此，蘿卜泡菜發(fā)酵第3 d為亞硝酸鹽濃度峰值期，第7 d為回落期，以這兩個(gè)時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)菌菌群的高通量測序研究。

圖1 蘿卜發(fā)酵液中亞硝酸鹽濃度和pH的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 The dynamic changes of the nitrite concentration and pH in the radish fermentation broth

2.2 細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)高通量測序文庫檢測

圖2 蘿卜泡菜不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落高通量測序文庫稀釋曲線（a）和OTU維恩圖譜（b）Fig.2 Rarefaction curve of high-throughput DNA sequencing library (a) and Venn diagram of bacterial OTU (b) during different fermentation periods of radish pickle

通過對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)測序，并對(duì)原始序列經(jīng)去除低質(zhì)量、Barcode和引物序列后，蘿卜發(fā)酵液亞硝酸鹽濃度峰值期（3 d）的回落期（7 d）樣品分別得到69444和66494條有效序列。去冗余后，獲得的373和349個(gè)細(xì)菌OTU，分屬于135和127個(gè)細(xì)菌屬（表1）。

根據(jù)細(xì)菌16S rRNA的測序文庫稀釋性曲線（圖2a），當(dāng)測序量超過40000條時(shí)，兩個(gè)處理雖然仍有新的 OTU被發(fā)現(xiàn)，但是整個(gè)曲線已經(jīng)趨于平緩，說明更深的測序幾乎不會(huì)產(chǎn)生更多的OTU，該測序文庫已經(jīng)達(dá)到飽和。

從圖中也可以看出相同序列數(shù)時(shí)，發(fā)酵第3 d的發(fā)酵液中細(xì)菌群落OTU多于發(fā)酵第7 d，說明蘿卜發(fā)酵液亞硝酸鹽濃度達(dá)到峰值時(shí)的細(xì)菌群落豐富度高于已經(jīng)回落期。通過比較 2個(gè)時(shí)期的 Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)同樣可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液亞硝酸鹽濃度峰值期的細(xì)菌群落豐富度和多樣性均高于回落期（表1）。

表1 高通量測序文庫質(zhì)量匯總Table 1 The information of high-throughput DNA sequencing library

維恩圖可以直觀展示兩個(gè)發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落的OTU組成的相似性、重疊情況以及特異性（圖2b）。蘿卜泡菜亞硝酸鹽濃度峰值期和回落期發(fā)酵液中共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為283（圖2B）。其中17個(gè)OTU（87%）分布在兩時(shí)期細(xì)菌群落Top10的優(yōu)勢細(xì)菌群落中。亞硝酸鹽濃度峰值期發(fā)酵液中特異性細(xì)菌OTU數(shù)量為76，而亞硝酸鹽濃度回落期發(fā)酵液中特異性細(xì)菌OTU數(shù)量為66，且均集中在僅占OTU總數(shù)量7%的細(xì)菌非優(yōu)勢類群中。這說明在經(jīng)過了6 d的發(fā)酵后，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)由多樣的趨于單一，一些細(xì)菌隨著亞硝酸鹽濃度和pH值的變化，成長為優(yōu)勢的菌群，搶占了發(fā)酵液中的生態(tài)位。為了進(jìn)一步明確發(fā)生變化的細(xì)菌類群，對(duì)OTUs進(jìn)行了物種注釋，揭示與亞硝酸鹽濃度和pH值變化相關(guān)的細(xì)菌類群。

2.3 蘿卜泡菜亞硝酸鹽含量不同時(shí)期優(yōu)勢細(xì)菌群落組成

圖3 蘿卜泡菜不同發(fā)酵時(shí)期在門（a）和屬（b）分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)TOP10構(gòu)成Fig.3 The TOP10 phylum (a) and genus (b) of bacterial community in two fermentation periods of radish pickle

蘿卜泡菜亞硝酸鹽峰值期（3 d）和回落期（7 d）時(shí)，發(fā)酵液細(xì)菌群落在門分類水平上的分布比例見圖3a。兩個(gè)時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成情況相似，但各細(xì)菌類群所占比例有較大差異。兩個(gè)時(shí)期細(xì)菌群落在門水平上具有相同的TOP10構(gòu)成。其中，亞硝酸鹽濃度峰值期時(shí)所占比例大于細(xì)菌總數(shù)1.0%的門包括：變形菌門（Proteobacteria，72.1%）占主要優(yōu)勢，之后是厚壁菌門（Firmicutes，18.9%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，4.5%）。亞硝酸鹽濃度回落期時(shí)所占比例大于細(xì)菌總數(shù) 1.0%的門包括：最優(yōu)勢的厚壁菌門（Firmicutes，84.0%），之后是變形菌門（Proteobacteria，10.5%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，2.7%）。

蘿卜泡菜亞硝酸鹽峰值期（3 d）和回落期（7 d）時(shí)，發(fā)酵液細(xì)菌群落在屬分類水平上的分布比例見圖3b。兩個(gè)發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成情況相似，但各細(xì)菌類群所占比例有較大差異。在亞硝酸鹽濃度峰值期時(shí)占優(yōu)勢的細(xì)菌屬分別為歐文氏菌屬（Erwinia，45.0%）、乳酸菌屬（Lactococcusc，10.5%）、氣單孢菌屬（Aeromonas，7.4%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.6%）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，6.0%）、代爾夫特菌屬（Delftia，5.1%）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium，4.4%）、魏斯氏菌屬（Weissella，4.3%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，2.2%）和片球菌屬（Pediococcus，1.7%）。在亞硝酸鹽濃度回落期，明串珠菌屬（Leuconostoc，27.5%）、乳球菌屬（Lactococcus，19.9%）、魏斯氏菌屬（Weissella，19.2%）和片球菌屬（Pediococcus，16.3%）等 4屬乳酸菌為優(yōu)勢細(xì)菌屬，之后依次為歐文氏菌屬（Erwinia，1.7%）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium，0.9%）、代爾夫特菌屬（Delftia，0.9%）、氣單孢菌屬（Aeromonas，0.7%）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，0.6%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，0.2%）。

2.4 蘿卜泡菜發(fā)酵液中優(yōu)勢細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育

圖4 蘿卜泡菜兩個(gè)發(fā)酵時(shí)期TOP10細(xì)菌菌屬OTU序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化Fig.4 The phylogeny of the OTU sequence from TOP10 bacterial genus in two periods of radish pickle

選取相對(duì)豐度TOP10的屬所對(duì)應(yīng)的OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行多序列比對(duì)，并結(jié)合物種注釋置信度信息進(jìn)行整合并繪制了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化圖（圖4）。第一層分支的顏色表示分別對(duì)應(yīng) TOP10屬名；第二層柱形的高度表示OTUs的相對(duì)豐度大小；第三層柱形的高度表示OTUs注釋的可信度。蘿卜泡菜發(fā)酵過程中相對(duì)豐度TOP10的細(xì)菌菌屬所有OTUs的物種注釋均具有較高的置信度。其中，氣單孢菌屬（Aeromonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc）發(fā)生了系統(tǒng)分化，具有2或3個(gè)不同的OTU序列。而屬于乳酸菌的乳酸菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）以及其他的4個(gè)細(xì)菌菌屬的 OTU序列沒有發(fā)生分化。說明在蘿卜泡菜發(fā)酵過程中，優(yōu)勢細(xì)菌屬?zèng)]有隨著亞硝酸鹽濃度和pH的變化而發(fā)生系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化。

3 討論

自上個(gè)世紀(jì)80年代起，泡菜的微生物發(fā)酵過程一直受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注[3,19]。已有研究結(jié)果表明，泡菜中亞硝酸鹽的降解可分為酶降解和酸降解，即微生物亞硝酸還原酶主導(dǎo)的酶降解和微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生有機(jī)酸引起的酸降解[19]。張慶芳等(2002)在MRS液體培養(yǎng)基中添加亞硝酸鹽后接種乳酸菌模擬發(fā)酵過程，并測定發(fā)酵液pH和亞硝酸鹽含量，結(jié)果表明發(fā)酵液 pH>4.5時(shí)，亞硝酸鹽的降解主要以乳酸菌本身酶降解為主。當(dāng) pH<4.0時(shí)，亞硝酸鹽的降解以酸降解為主，且pH低于3.5下時(shí)，亞硝酸鹽降解明顯。因此，在泡菜發(fā)酵過程中，pH值與微生物引發(fā)的酶降解和酸降解密切相關(guān)，且4.0可能是酶降解和酸降解的分界點(diǎn)[20]。本研究中，發(fā)酵第3 d至發(fā)酵第7 d的pH值從4.8降低至3.8，該階段蘿卜泡菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽的降解可能以酶降解為主；而第7 d開始，pH一直保持在4.0以下，該階段蘿卜泡菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽的降解可能以酸降解為主。

微生物主導(dǎo)的亞硝酸鹽酶降解過程，是指亞硝酸鹽在微生物亞硝酸鹽還原酶（Nir）的作用下，被還原為一氧化氮（NO），該還原過程是微生物主導(dǎo)的氮素反硝化過程的關(guān)鍵步驟。編碼亞硝酸鹽還原酶的基因?yàn)橐糟~離子為酶活性位點(diǎn)的 nirK基因和以鐵離子為酶活位點(diǎn)的nirS基因[21]。盡管很多報(bào)道指出泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌可以降解亞硝酸鹽，如植物乳桿菌、乳鏈球菌、干酪乳桿菌、賴氏乳桿菌、嗜熱乳鏈球菌和戊糖片球菌等[22～24]。然而，通過對(duì)NCBI、KEGG和Fungene三個(gè)數(shù)據(jù)庫中記錄的細(xì)菌全基因組進(jìn)行篩查，發(fā)并沒有發(fā)現(xiàn)目前上述乳酸菌菌株具有編碼亞硝酸鹽還原酶的nirK和nirS基因，而非乳酸菌細(xì)菌，如Pseudomonas屬和 Aeromonas屬則已經(jīng)明確了具有nirK基因。因此，在沒有得到乳酸菌屬細(xì)菌具有編碼亞硝酸鹽還原酶的nirK和nirS基因的可靠證據(jù)前，蘿卜泡菜中進(jìn)行亞硝酸鹽酶降解的細(xì)菌類群更應(yīng)被認(rèn)為廣泛分布在非乳酸菌類群中。然而，這一認(rèn)識(shí)還需對(duì)相關(guān)菌株分離并定性研究后才能定論。

微生物主導(dǎo)的亞硝酸鹽酸降解過程，是指泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸使發(fā)酵液的pH迅速降低，而低pH值導(dǎo)致亞硝酸鹽的降解。亞硝酸鹽在酸性條件下，反應(yīng)生成不穩(wěn)定的HNO2，而HNO2則經(jīng)過不穩(wěn)定的N2O3，繼續(xù)分解為NO2和NO[25]。所以溶液的pH值越低，亞硝酸鹽的降解量越大。因此，本研究中發(fā)酵第7 d的pH為3.8，此時(shí)亞硝酸鹽降解過程很可能以酸降解為主，這與第7 d時(shí)占絕對(duì)優(yōu)勢的明串珠菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬4種乳酸菌直接相關(guān)。這4種乳酸菌產(chǎn)生的大量有機(jī)酸可能促使亞硝酸鹽被完全降解，或者是使其降解速率遠(yuǎn)大于生成速率，導(dǎo)致亞硝酸鹽產(chǎn)生完全被壓制。

關(guān)于泡菜亞硝酸鹽的研究以前集中在降解過程，對(duì)亞硝酸鹽產(chǎn)生機(jī)制的解析有助于提高降解速率。亞硝酸鹽是微生物主導(dǎo)的氮素循環(huán)過程中重要的中間產(chǎn)物之一，產(chǎn)生過程包括微生物的反硝化作用（硝酸鹽還原成亞硝酸鹽）和硝化作用（銨鹽氧化成亞硝酸鹽）等。本研究在蘿卜泡菜發(fā)酵液中沒有檢測到氨氧化細(xì)菌和古菌，因此我們認(rèn)為微生物反硝化作用是蘿卜泡菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生和積累的原因。不同種類蔬菜的硝酸鹽含量不同，根菜類>綠葉菜類>白菜類>豆類。蘿卜作為肉質(zhì)根菜類蔬菜，體內(nèi)具有大量的硝酸鹽[26]，為微生物反硝化作用提供了充足的底物。已有報(bào)道指出微生物具有兩種蛋白酶NarG和NapA，可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[27]。具有編碼兩種蛋白酶的 narG和 napA基因可以作為判斷其具有硝酸鹽還原能力的依據(jù)。因此，根據(jù)fungene數(shù)據(jù)庫最新的全基因組序列進(jìn)行分析，蘿卜泡菜在發(fā)酵第3 d時(shí)出現(xiàn)的優(yōu)勢性的變形菌門細(xì)菌Erwinia屬具有narG，Shigella屬具有napA，Aeromonas和Pseudomonas屬同時(shí)具有napA和narG。因此，蘿卜泡菜發(fā)酵液中優(yōu)勢性的變形菌門細(xì)菌通過具有的蛋白酶NarG和NapA，通過反硝化作用將發(fā)酵液中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，造成發(fā)酵液中亞硝酸鹽濃度的增加，從而導(dǎo)致蘿卜泡菜在第 3 d亞硝酸鹽濃度達(dá)到峰值。因此，如果對(duì)這些非乳酸菌細(xì)菌類群加以控制，很可能會(huì)從根本上抑制泡菜亞硝酸鹽的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

通過對(duì)蘿卜泡菜發(fā)酵液中隨亞硝酸鹽濃度和 pH值變化而演替的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的解析結(jié)果表明，變形菌門的部分細(xì)菌類群可能在蘿卜泡菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽濃度產(chǎn)生和累積過程、以及亞硝酸鹽酶降解過程中發(fā)揮重要的作用。而厚壁菌門的乳酸菌類群及其產(chǎn)生的低pH值，可能在亞硝酸鹽酸降解過程中起關(guān)鍵性作用。

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