張鈺，李杰慶，李濤，劉鴻高，王元忠

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南昆明650200）（3.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南玉溪 653100）

隨著食品儲(chǔ)藏時(shí)間增加，微生物增殖、物理及化學(xué)變化等因素，導(dǎo)致其商品品質(zhì)發(fā)生改變[1]。野生食用菌生長(zhǎng)受季節(jié)限制，為整年供應(yīng)，銷售商將采收后的野生食用菌進(jìn)行加工處理（干燥、脫水等），限制微生物繁殖速度[2]。加工處理過(guò)程未對(duì)野生食用菌進(jìn)行滅菌處理，儲(chǔ)藏較長(zhǎng)時(shí)間會(huì)引起其內(nèi)部微生物大量繁殖，產(chǎn)生胺類、硫醇、硫化氫和吲哚等化合物，對(duì)人體健康造成危害[1,3]。揮發(fā)性物質(zhì)是影響野生食用菌風(fēng)味的關(guān)鍵[4]，儲(chǔ)藏過(guò)程中受溫度、光照等因素的影響，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可能揮發(fā)或被氧化，從而影響野生食用菌口感[5,6]，使野生食用菌超過(guò)最佳食用期限。由此可見，研究不同儲(chǔ)藏年限的野生食用菌干品差異對(duì)保證其品質(zhì)具有重要意義。

紫外（UV）光譜與傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、靈敏可靠和簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中草藥和食品鑒別研究[7～10]。與單一儀器相比，多源光譜數(shù)據(jù)融合能夠反映更多樣品化學(xué)信息，更加全面解釋樣品屬性，從不同的層面反映樣品間差異[11]，可以提高樣品分類準(zhǔn)確率。Biancolillo等[12]采取中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略將五種光譜融合，成功鑒別了不同地區(qū)的意大利啤酒，提高了樣品分類準(zhǔn)確率。Sun等[13]將近紅外與中紅外光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)融合，準(zhǔn)確鑒別大黃的真?zhèn)纹?。Dankowska[14]將熒光光譜數(shù)據(jù)與 UV數(shù)據(jù)融合，對(duì)可可脂摻假進(jìn)行有效鑒別。數(shù)據(jù)融合對(duì)不同種類、不同產(chǎn)地和不同部位等方面研究較多，對(duì)不同儲(chǔ)藏年限樣品研究相對(duì)較少，因此本文對(duì)不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌進(jìn)行研究。

中國(guó)有牛肝菌28屬，397種，其中199種為可食用物種[15]。云南牛肝菌資源豐富，共有224種，可食用物種有 144種，可食用牛肝菌種類占全國(guó)的72.36%[16]。絨柄牛肝菌（Boletus tomentipes）隸屬于牛肝菌科（Boletaceae），又名毛腳牛肝菌、黑牛肝[2]。其子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、多糖、核苷類、三萜類等有機(jī)化合物，具有抗氧化損傷、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗炎癥的作用[17～22]，其獨(dú)特的風(fēng)味和低糖、低鹽、低脂肪等特點(diǎn)被譽(yù)為“天然營(yíng)養(yǎng)健康的多功能食品”，受到越來(lái)越多消費(fèi)者青睞[23]。

本研究采集5個(gè)儲(chǔ)藏年限，77個(gè)絨柄牛肝菌子實(shí)體的UV與FT-IR光譜，將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），分別建立UV、FT-IR、低級(jí)數(shù)據(jù)融合與中級(jí)數(shù)據(jù)融合模型，比較四種模型分類正確率，確定最佳分類模型，建立快速鑒別不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌的方法，以期為野生食用菌的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌樣品分別于 2011、2012、2014、2015和2016年采集（表1），均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定為絨柄牛肝菌（Boletus tomentipes Earle）。樣品采集后去除雜質(zhì)，清水洗凈，50 ℃烘干至恒重。樣品粉碎后，過(guò)60目篩，保存于自封袋中備用。

表1 不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌樣品Table 1 Samples of Boletus tomentipes with different storageperiods

1.2 儀器與試劑

UV-2550紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）、傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)珀金埃爾默公司，配有DTGS檢測(cè)器）、YP-2型壓片機(jī)（上海市山岳科學(xué)儀器有限公司）、60目不銹鋼篩盤（浙江上虞市道墟五四儀器廠）、SY3200-T超聲波清洗儀（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）、奧豪斯電子分析天平（梅特勒-托多儀器有限公司）、Milli-Q Academic純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）、雙圈定性濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）、101A-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）、溴化鉀（分析純；天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、氯仿（分析純；云南汕滇藥業(yè)有限公司）。

1.3 紫外光譜的采集

準(zhǔn)確稱取0.07 g樣品于25 mL試管中，加入8 mL氯仿，超聲提取30 min后過(guò)濾得氯仿提取液。紫外光譜掃描范圍230～600 nm，采樣間隔1.0 nm，狹縫寬1.0 nm。測(cè)定前空白氯仿溶液作為參比溶液與測(cè)試溶液進(jìn)行基線校正。然后測(cè)定不同樣品提取液UV光譜。

1.4 紅外光譜信息采集

稱取樣品1.5±0.2 mg，溴化鉀100±2 mg，置于瑪瑙研缽中混合研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入模具中壓成厚度均勻的薄片。將儀器分辨率設(shè)置為4 cm-1，掃描范圍4000～400 cm-1，預(yù)熱30 min后測(cè)定光譜，掃描前使用空白片去除背景中二氧化碳和水的干擾，樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均光譜。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Omnic 8.2軟件對(duì)樣品FT-IR光譜進(jìn)行吸光度轉(zhuǎn)換、縱坐標(biāo)歸一化、自動(dòng)基線校正處理，SIMCA13.0+軟件對(duì)樣品FT-IR和UV光譜進(jìn)行卷積平滑（Savitzky-Golay，SG）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（Standard normal variate，SNV）、正交信號(hào)校正（Orthogonal signal correction，OSC）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、一階導(dǎo)數(shù)（First-derivative，1-D）和二階導(dǎo)數(shù)（Second-derivative，2-D）處理，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA。Origin 8.0軟件繪制UV、FT-IR光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲(chǔ)藏年限牛肝菌UV光譜分析

2.1.1 絨柄牛肝菌UV光譜

圖1 不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌平均紫外光譜Fig.1 Average UV spectra of B. tomentipes with different storage periods

圖1為5個(gè)儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌，在240～400 nm波長(zhǎng)范圍的平均UV光譜圖，在波長(zhǎng)263、273、283與295 nm處有特征吸收峰，不同儲(chǔ)藏年限樣品的UV光譜峰形差異較大，儲(chǔ)藏1年樣品峰形不同于其它四類樣品。儲(chǔ)藏2年與3年、5年與6年樣品峰形相似，特征吸收峰的吸光度不同。儲(chǔ)藏5年與6年樣品的光譜在263 nm處的波峰比其它三類樣品更明顯。表明以氯仿為溶劑的樣品提取液中低極性化合物含量可能存在差異。

2.1.2 PLS-DA分析

PLS-DA是基于偏最小二乘回歸的一種有監(jiān)督的判別分類方法，利用自變量矩陣X和分類變量Y建立回歸模型。Q2表示PLS-DA模型預(yù)測(cè)能力的累計(jì)百分比，Q2越大模型預(yù)測(cè)能力越好[24]，R2Y為主成分累積貢獻(xiàn)率。不同方法處理樣品原始光譜后，結(jié)合PLS-DA分析，比較預(yù)處理方法對(duì)分類的影響，選擇最佳預(yù)處理方法。由PLS-DA模型可知，四個(gè)模型前5個(gè)主成分的 Q2均為最大值，通過(guò)比較不同預(yù)處理方法的PLS-DA模型前5個(gè)主成分的Q2、R2Y值（表2），確定最佳預(yù)處理方法。SG+2-D處理后前5個(gè)主成分Q2、R2Y最大，分別為56.44%、68.22%。表明選擇SG+2-D對(duì)樣品紫外光譜進(jìn)行預(yù)處理，可以改善樣品分類效果。

圖2 不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌紫外光譜PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score plot of B. tomentipes with different storage periods by UV

牛肝菌樣品UV光譜經(jīng)SG+2-D預(yù)處理后，進(jìn)行PLS-DA分析，圖2為UV光譜PLS-DA三維得分圖，儲(chǔ)藏年限為1年、2年和3年的牛肝菌樣品無(wú)法被區(qū)分，表明儲(chǔ)藏年限較短樣品（1、2和3年）相似度較高，其低極性化合物含量可能變化較小。儲(chǔ)藏年限較長(zhǎng)（5和6年）與較短的樣品基本能區(qū)分，表明隨著儲(chǔ)藏年限的增加，其低極性化合物含量可能變化較大。

表2 不同方法預(yù)處理紫外光譜后PLS-DA模型Q2值和R2YTable 2 Q2 and R2Y of PLS-DA models of UV spectra with different pretreatment

2.2 不同年份絨柄牛肝菌FT-IR光譜分析

2.2.1 FT-IR光譜分析

圖3為不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌的平均FT-IR光譜。由圖可知，不同儲(chǔ)藏年限樣品FT-IR光譜在3353、2931、1646、1545、1384、1079 cm-1等附近有明顯特征吸收峰，3353 cm-1附近主要為O-H與N-H伸縮振動(dòng)吸收峰；2931 cm-1附近為亞甲基C-H反對(duì)稱的伸縮振動(dòng)吸收峰；1646 cm-1附近主要為蛋白質(zhì)酰胺I帶的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰；1545 cm-1附近主要為蛋白質(zhì)酰胺II帶的C-O伸縮振動(dòng)；1384 cm-1附近為亞甲基的彎曲振動(dòng)；1079～1031 cm-1吸收峰為C-O和C-C伸縮振動(dòng)[25]。以上特征吸收峰反映牛肝菌樣品糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等化合物[26]，其特征峰的吸收強(qiáng)度和位置的差異，表明樣品間這些物質(zhì)含量可能存在差異。

圖3 不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌的平均紅外光譜Fig.3 Average FT-IR spectra of B. tomentipes samples with different storage periods

2.2.2 PLS-DA分析

圖4 絨柄牛肝菌紅外光譜PLS-DA得分圖Fig.4 PLS-DA score plot of B. tomentipes samples by FT-IR

受儀器噪音、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、樣品差異等因素干擾，原始光譜中包含大量無(wú)關(guān)信息。采用基線校正、縱坐標(biāo)歸一化、MSC、SNV和2-D對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，能有效的減少噪音的干擾，減小基線漂移對(duì)模型的影響，放大和區(qū)分重疊譜帶的化學(xué)信息[27]。將預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+13.0軟件定性識(shí)別，比較不同預(yù)處理方法的分類效果，選擇最佳預(yù)處理方法。表3為不同方法預(yù)處理紅外光譜后PLS-DA模型Q2最大值，及其對(duì)應(yīng) R2Y值。經(jīng) SG+1-D預(yù)處理后PLS-DA模型前11個(gè)主成分Q2最大，為67.87%，R2Y為87.93%。1-D+SNV預(yù)處理后PLS-DA模型前15個(gè)主成分 Q2最大，為 71.21%，R2Y為 92.94%。SG+2-D+MSC預(yù)處理后PLS-DA模型前13個(gè)主成分Q2最大，為77.42%，R2Y為93.98%。SG+2-D+SNV預(yù)處理后 PLS-DA模型前 13個(gè)主成分Q2最大，為77.44%，R2Y為94.02%。SG+2-D+SNV預(yù)處理后Q2與R2Y值均大于其它方法，表明SG+2-D+SNV為最佳光譜預(yù)處理方法。

對(duì)牛肝菌樣品光譜進(jìn)行SG + 2-D + SNV處理后，進(jìn)行PLS-DA分析，圖4為77個(gè)牛肝菌樣品PLS-DA得分圖，儲(chǔ)藏年限2年、5年和6年樣品能很好的區(qū)分開，儲(chǔ)藏年限1年與3年樣品不能很好的聚為一類。難以區(qū)分不同儲(chǔ)藏年限牛肝菌樣品。

表3 不同方法預(yù)處理紅外光譜后PLS-DA模型Q2最大值Table 3 Q2 and R2Y of PLS-DA models of FT-IR spectra with different pretreatment

2.3 數(shù)據(jù)融合分析

圖5 絨柄牛肝菌低級(jí)數(shù)據(jù)融合PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot of B. tomentipes by low-level data fusion

圖6 紫外光譜PLS-DA R2Y、Q2累積圖Fig.6 R2Y and Q2 plot of PLS-DA of UV spectra

圖7 紅外光譜PLS-DA R2Y、Q2累積圖Fig.7 R2Y and Q2 plot of PLS-DA of FT-IR spectra

圖8 絨柄牛肝菌中級(jí)數(shù)據(jù)融合后PLS-DA得分圖Fig.8 PLS-DA score plot of B. tomentipes by mid-level data fusion

低級(jí)數(shù)據(jù)融合，將預(yù)處理后的UV與FT-IR數(shù)據(jù)歸一化后直接串聯(lián)，得到一個(gè)新的數(shù)據(jù)矩陣，建立PLS-DA模型進(jìn)行鑒別分析。圖5為77個(gè)樣品主成分三維得分圖，由圖可知儲(chǔ)藏5年部分樣品與1年樣品混在一起，較難區(qū)分開，其它幾個(gè)儲(chǔ)藏年限樣品均很好的聚為一類。

中級(jí)數(shù)據(jù)融合前對(duì)多源光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA降維，挖掘出與牛肝菌儲(chǔ)藏年限差異有關(guān)的信息。在預(yù)處理的基礎(chǔ)上，對(duì)原始數(shù)據(jù)中利于分類的特征變量進(jìn)行挖掘，將篩選的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行連接，得到新的數(shù)據(jù)矩陣，建立PLS-DA模型。從UV與FT-IR的R2Y、Q2累積圖(圖6、7)可知，UV與FT-IR模型前5個(gè)與前13個(gè)主成分Q2最大，模型的預(yù)測(cè)能力最好，提取模型前5個(gè)與前13個(gè)主成分為特征變量。將提取的特征變量進(jìn)行融合建立PLS-DA模型。

圖8為中級(jí)數(shù)據(jù)融合后的PLS-DA三維得分圖，五個(gè)儲(chǔ)藏年限樣品可被明顯區(qū)分，且同一儲(chǔ)藏年限的樣品聚類效果好，每一類樣品均聚類集中，僅儲(chǔ)藏年限3年的3-11、3-12、3-13樣品不能與同一儲(chǔ)藏年限樣品聚為一類。相較于UV、FT-IR和低級(jí)數(shù)據(jù)融合策略，中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略對(duì)不同儲(chǔ)藏年限樣品的分類效果最好，能將相似度較高的樣品進(jìn)行區(qū)分，可以用于不同儲(chǔ)藏年限的絨柄牛肝菌的鑒別。

2.3.1 不同模型分類結(jié)果比較分析

隨機(jī)選擇 1-1～1-4、2-13～2-16、3-3～3-4、3-11～3-13、4-6～4-9、4-16～4-18、5-4～5-6，23個(gè)樣品作為預(yù)測(cè)集，其余54個(gè)樣品為訓(xùn)練集，采用UV、FT-IR、低級(jí)數(shù)據(jù)融合和中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略，分別建立PLS-DA模型。當(dāng)訓(xùn)練集與預(yù)測(cè)集的預(yù)測(cè)值在 0.5～1.5范圍，樣品分類正確，預(yù)測(cè)值越接近于1，分類效果越好，小于0.5或大于1.5的樣品分類錯(cuò)誤[28]，不同類型模型的預(yù)測(cè)結(jié)果見表4，中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略樣品錯(cuò)判數(shù)最少，僅3個(gè)分類錯(cuò)誤。

單獨(dú)采用UV建立分類判別模型效果最差，10個(gè)樣品分類錯(cuò)誤，通過(guò)比較四種模型，中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略分類效果最佳，訓(xùn)練集、預(yù)測(cè)集和樣品的分類準(zhǔn)確率均最高。

評(píng)價(jià) PLS-DA模型訓(xùn)練集常用的參數(shù)有 R2cal、RMSECV。當(dāng)內(nèi)部驗(yàn)證決定系數(shù)（Internal validation determines the coefficients，R2cal）越接近于1，內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方根誤差（Root mean squares error of cross-validation，RMSECV）越小，訓(xùn)練集的模型預(yù)測(cè)能力越好[29]。

從表5可知，五個(gè)儲(chǔ)藏年限樣品R2cal、RMSECV平均值中，中級(jí)數(shù)據(jù)融合的R2cal平均值最接近于1、且RMSECV平均值最?。恢徊捎米贤夤庾V進(jìn)行鑒別時(shí)，R2cal平均值最小，RMSECV最大。綜上表明，采用中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略能區(qū)分相似度較高的樣品，分類效果最佳。

通過(guò)利用UV、FT-IR、低級(jí)數(shù)據(jù)融合和中級(jí)數(shù)據(jù)融合模型，對(duì)不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示不同模型分類準(zhǔn)確率，中級(jí)數(shù)據(jù)融合>低級(jí)數(shù)據(jù)融合>FT-IR>UV，數(shù)據(jù)融合策略優(yōu)于采用一種光譜分類效果，這與Anibal C V D[30]等、Márquez C[31]等摻假鑒別研究相似。

低級(jí)數(shù)據(jù)融合模型受無(wú)關(guān)信息影響，降低模型性能[32]，中級(jí)數(shù)據(jù)融合對(duì)原始數(shù)據(jù)中利于分類的特征變量進(jìn)行挖掘，中級(jí)數(shù)據(jù)融合分類效果優(yōu)于低級(jí)數(shù)據(jù)融合。因此中級(jí)數(shù)據(jù)融合也可以用于不同儲(chǔ)藏年限樣品的鑒別；UV、FT-IR、低級(jí)數(shù)據(jù)融合PLS-DA模型，儲(chǔ)藏年限較短的幾類樣品混在一起，不易區(qū)分。與周瓊瓊[33]等、Ning J M[34]等對(duì)茶儲(chǔ)藏年限研究結(jié)果相似，儲(chǔ)藏年限較短的樣品中內(nèi)含物質(zhì)含量無(wú)顯著變化。隨儲(chǔ)藏年限增加，樣品內(nèi)蛋白質(zhì)、可溶性糖等內(nèi)含物質(zhì)含量可能減少。

表4 不同模型的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Forecasting results of different models

表5 不同模型的R2cal和RMSECVTable 5 R2cal and RMSECV of different models

3 結(jié)論

采用FT-IR和UV光譜法，測(cè)定5個(gè)不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌的FT-IR和UV光譜，運(yùn)用SG、1-D、2-D、OSC、MSC、SNV預(yù)處理方法對(duì)原始光譜進(jìn)行優(yōu)化處理，結(jié)果顯示SG+2-D+SNV和SG+2-D分別為FT-IR和UV光譜的最優(yōu)預(yù)處理，UV、FT-IR、低級(jí)和中級(jí)數(shù)據(jù)融合PLS-DA模型，總樣品分類錯(cuò)誤數(shù)分別為 10、6、4、3，中級(jí)數(shù)據(jù)融合>低級(jí)數(shù)據(jù)融合>FT-IR>UV，中級(jí)數(shù)據(jù)融合顯示出更高的分類正確率。說(shuō)明數(shù)據(jù)融合策略利用不同來(lái)源數(shù)據(jù)的互補(bǔ)性，增加樣品化學(xué)信息，從不同的層面反映牛肝菌個(gè)體差異，相較于單一儀器數(shù)據(jù)融合顯示出更高分類正確率。中級(jí)數(shù)據(jù)融合對(duì)原始數(shù)據(jù)中分類有關(guān)信息進(jìn)行挖掘，相較于低級(jí)數(shù)據(jù)融合分類效果更好。中級(jí)數(shù)據(jù)融合策略結(jié)合PLS-DA為不同儲(chǔ)藏年限絨柄牛肝菌的鑒別分析提供了方法，同時(shí)為其品質(zhì)保證提供了新思路。

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