韓晴，王贊，章晶晶，李月華，楊嵐，周巍，張巖，張志勝

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000）（2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050071）

DNA條形碼類似于商品條形碼，可以有效的辨別各種動(dòng)物、植物[1～3]。它是現(xiàn)今可用于生物多樣性、生態(tài)學(xué)、食品檢測(cè)、生物檢驗(yàn)檢疫等方面的一種新興技術(shù)。其在動(dòng)物源性食品中的應(yīng)用已相對(duì)成熟，目前常用于動(dòng)物DNA條形碼的基因?yàn)镃OI。而在植物源性食品中的應(yīng)用正在迅猛發(fā)展[4～9]，常用于植物DNA條形碼的基因組有ITS、matK、rbcL、trnH-psbA，它們被認(rèn)為是潛在的優(yōu)秀的植物 DNA條形碼候選序列[10～12]。DNA條形碼技術(shù)雖多在動(dòng)植物分類學(xué)上有所應(yīng)用[13,14]，但在國(guó)外該技術(shù)也成功的應(yīng)用在了某些食品中植物源性成分的鑒定[15,16]。

杏仁露作為植物蛋白飲料中的一種，老少皆宜。同時(shí)也是一種深加工食品，有著復(fù)雜的加工工藝，使它失去了本身的性狀，應(yīng)用傳統(tǒng)的分類學(xué)無法對(duì)其辨別。這就給了不法商家可乘之機(jī)，進(jìn)行摻假造假，損害消費(fèi)者的利益。找到行之有效的鑒別方法，對(duì)保護(hù)廣大消費(fèi)者的權(quán)益意義重大。

目前對(duì)于工藝復(fù)雜的深加工食品摻假檢測(cè)常采用設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)提取的樣品總基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，但需要根據(jù)可能摻入的物種去設(shè)計(jì)不同的特異性引物，如魏曉璐等[17]對(duì)核桃露中花生和大豆源性成分進(jìn)行檢測(cè)，分別設(shè)計(jì)了核桃、花生、大豆的特異性引物；覃芳芳等[18]用了大豆和杏仁的內(nèi)源基因設(shè)計(jì)引物對(duì)杏仁產(chǎn)品中杏仁成分檢測(cè)。而應(yīng)用植物DNA條形碼技術(shù)設(shè)計(jì)的通用引物可以達(dá)到一次檢測(cè)出結(jié)果的目的，更加方便快捷、檢測(cè)效率更高。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究利用植物DNA條形碼技術(shù)對(duì)杏仁露中花生源性成分進(jìn)行鑒別，建立一種檢測(cè)方法，同時(shí)也為相關(guān)領(lǐng)域檢測(cè)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻、榛子，力興源杏仁露、熱河杏仁露、太平洋杏仁露、樺維杏仁露、露美達(dá)杏仁露、露露杏仁露、哈露杏仁露、樂野杏仁露：石家莊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市。

深加工食品DNA提取試劑盒：天根公司；酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)：北京酷來博科技有限公司；異丙醇(分析純)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇(分析純)：天津歐博凱化工有限公司；Premix TaqTM：TaKaRa；2xSuperReal PreMix(Probe)：天根公司；杏仁、花生特異性引物和探針的合成、PCR擴(kuò)增所用通用引物合成、PCR產(chǎn)物測(cè)序：上海生工公司；GelRedTM：Biotium；50x TAE Buffe：生工公司；瓊脂糖：Vivantis；100 bp、1 kb DNA Ladder：Thermo。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

樣本基因組DNA的提取方法，均采用優(yōu)化后的試劑盒法進(jìn)行提?。?1)取經(jīng)液氮充分研磨后的樣本組織約100 mg至滅菌離心管中，加入500 μL緩沖液GMO1 和 20 μL 的 Proteinase K(20 mg/μL)，渦旋震蕩1 min；(2)56 ℃孵育1 h，其間每隔15 min將其上下顛倒震蕩一次；(3)等體積加入酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，12000 r/min離心5 min；(4)將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入200 μL的緩沖液GMO2，充分混勻，渦旋震蕩1 min，靜置10 min；(5)12000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；(6)向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，-20 ℃靜置30 min，12000 r/min離心3 min，棄上清，保留沉淀；(7)加入700 μL 的70%乙醇，渦旋震蕩5 s，12000 r/min離心2 min，棄上清；(8)重復(fù)(7)；(9)開蓋，室溫放置至徹底晾干殘留的乙醇；(10)加入50 μL的洗脫緩沖液TE，渦旋震蕩1 min，即為提取的基因組DNA溶液。杏仁露樣品的提取方法：先對(duì)杏仁露進(jìn)行預(yù)處理（1）取2 mL樣品于離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后靜置15 min，12000 r/min離心10 min，棄上清；（2）重復(fù)步驟（1）；其余步驟同上述提取過程。

1.3.2 樣本準(zhǔn)確性的測(cè)定

為保證樣本準(zhǔn)確性，利用NanoDrop Lite測(cè)定提取的基因組DNA的A260/A280值和濃度。以提取的基因組DNA為模板，以杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻、榛子的特異性引物和探針(參見標(biāo)準(zhǔn) SN/T 1961.9-2013、SN/T 1961.2-2007、SN/T 1961.6-2013、SN/T 1961.19-2013、SN/T 1961.12-2013和 SN/T 1961.8-2013)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，觀察增幅情況，以確定樣本的準(zhǔn)確性。采用25 μL的擴(kuò)增體系中添加12.5 μL 2xSuperReal PreMix(Probe)、0.75 μL 上游引物(10 μmol/L)、0.75 μL 下游引物(10 μmol/L)、0.5 μL 探針(10 μmol/L)、2.0 μL DNA 模板(30 μg/mL～100 μg/mL)、8.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火/延伸20 s采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

引物 ITS2-1、ITS2-2、ITS2-3、matK-2、matK-3、rbcL-1、trnH-psbA-1、trnH-psbA-2：參考于文獻(xiàn)[19～24]，其中引物trnH-psbA-1參考于對(duì)陸生植物DNA條形碼的相關(guān)研究，引物rbcL-1適用于除早熟禾、萵苣屬、佩蘭屬、櫟屬、蒲黃、樺木屬外物種的研究，引物ITS2-1、ITS2-2、ITS2-3、matK-2、matK-3、trnH-psbA-2分別為對(duì)蕓香科植物、杜鵑屬植物、蒲黃、萹蓄、茄屬茄科、苦苣菜屬和石榴這些物種的研究。引物序列見表 1。引物 matK-1、rbcL-2：通過 BOLD 數(shù)據(jù)庫(http://www.barcodinglife.org)引物檢索篩選Primer，引 物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.3.4 PCR擴(kuò)增

雖然現(xiàn)金流動(dòng)性較強(qiáng)，但其盈利能力并不高。Jenson（1986）提出的自由現(xiàn)金流量假說認(rèn)為，如果公司持有過多不必要的現(xiàn)金，管理者會(huì)不知不覺地實(shí)施現(xiàn)金濫用，從而盲目地進(jìn)行投資項(xiàng)目，這在無形之間增加了企業(yè)經(jīng)營(yíng)期間的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)，也是對(duì)股東權(quán)益損害較大的一種自私自利的行為。由此可知，董事會(huì)需要抑制這種惡性投資行為來提高現(xiàn)金配置效率。但是當(dāng)前現(xiàn)狀是不論出于什么樣的原因，很多公司都愿意超額持有現(xiàn)金量以滿足自己的財(cái)務(wù)報(bào)表的需求。

利用設(shè)計(jì)的各引物與各樣本進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，50 μL 的擴(kuò)增體系中添加25 μL Premix TaqTM、2 μL 上游引物(10 μmol/L)、2 μL 下游引物(10 μmol/L)、4 μL DNA 模板(30 μg/mL～100 μg/mL)、17 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)入循環(huán)：95 ℃變性30 s、50 ℃ (ITS2-1、ITS2-3、matK-1、matK-2、matK-3、rbcL-1)或 55 ℃ (ITS2-2、rbcL-2、trnH-psbA-1、trnH-psbA-2)退火30 s、72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃總延伸10 min。待反應(yīng)完成后取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序及比對(duì)

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于-20 ℃冷凍，然后裝入提前加入冰袋的保溫箱中送上海生工公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物同于擴(kuò)增引物。所得的測(cè)序結(jié)果刪除兩端引物序列，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，同時(shí)結(jié)合BOLD數(shù)據(jù)庫(http://www.boldsystems.org)對(duì)樣品的序列進(jìn)行鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的杏仁基因組DNA結(jié)果Fig.1 Almond genome DNA by real time fluorescence PCR

2.1 樣本準(zhǔn)確性的測(cè)定

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的花生基因組DNA結(jié)果Fig.2 Peanut genome DNA by real time fluorescence PCR

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的核桃基因組DNA結(jié)果Fig.3 Walnut genome DNA by real time fluorescence PCR

對(duì)提取的基因組DNA的A260/A280值和濃度進(jìn)行測(cè)定，A260/A280值為 1.7～2.0，濃度控制在 30 μg/mL～100 μg/mL，有利于試驗(yàn)后續(xù)進(jìn)行[24]。為保證樣本的準(zhǔn)確性，利用實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)對(duì)提取的杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻和榛子基因組DNA進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖1～6所示。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)Ct值<30.0(杏仁、芝麻)、Ct值≤35.0(核桃、大豆、榛子)、Ct值≤40.0（花生），則判定為陽性，由圖1和圖6顯示Ct值均小于30.0，陰性和空白對(duì)照均無起跳，證明本試驗(yàn)的樣本均準(zhǔn)確，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的大豆基因組DNA結(jié)果Fig.4 Soybean genome DNA by real time fluorescence PCR

圖5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的芝麻基因組DNA結(jié)果Fig.5 Sesame genome DNA by real time fluorescence PCR

圖6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的榛子基因組DNA結(jié)果Fig.6 Hazelnut genome DNA by real time fluorescence PCR

2.2 PCR擴(kuò)增效果

分別以文獻(xiàn)和BLOD提供的引物與六類物種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以無菌雙蒸水作為空白對(duì)照[25]，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)條件經(jīng)過多次優(yōu)化后，結(jié)果表明引物ITS2-1、ITS2-3、matK-1、matK-2、matK-3、rbcL-1不能完全擴(kuò)增出六個(gè)物種，這幾對(duì)引物通用性較差，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中被排除。引物 ITS2-2、rbcL-2、trnH-psbA-1、trnH-psbA-2能全部擴(kuò)增出六個(gè)物種，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后結(jié)果見圖7～10。

圖7 引物ITS2-2與六個(gè)樣本DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.7 Result of primer ITS2-2 in six samples

圖8 引物rbcL-2與六個(gè)樣本DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.8 Result of primer rbcL-2 in six samples

圖9 引物trnH-psbA-1與六個(gè)樣本DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.9 Result of primer trnH-psbA-1 in six samples

圖10 引物trnH-psbA-2與六個(gè)樣本DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.10 Result of primer trnH-psbA-2 in six samples

2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析

將引物ITS2-2、rbcL-2、trnH-psbA-1、trnH-psbA-2與六個(gè)樣本擴(kuò)增后 PCR產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果刪除兩端引物序列，提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，同時(shí)使用BOLD數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析[26]。

結(jié)果表明比對(duì)結(jié)果均成功，其中引物trnH-psbA-2比對(duì)結(jié)果相似度在90%以下，其余引物比對(duì)結(jié)果相似度均在97%及以上，后續(xù)試驗(yàn)排除引物trnH-psbA-2；因引物rbcL-2擴(kuò)增的目的片段較長(zhǎng)，超過1000 bp，不便于測(cè)序工作進(jìn)行，故后續(xù)試驗(yàn)中也被排除。經(jīng)過以上試驗(yàn)過程與結(jié)果分析，引物ITS2-2、trnH-psbA-1可應(yīng)用于六類物種的鑒別。

2.4 摻假模型的建立

因試驗(yàn)不可能完全模擬實(shí)際生產(chǎn)，試驗(yàn)所用樣品量較少，若直接通過原料水平摻假必然造成很大的誤差，所以本試驗(yàn)中采取DNA水平摻假，再經(jīng)換算得到原料水平摻假。

在杏仁基因組 DNA中人為摻入花生基因組DNA，其中花生基因組DNA占總基因組DNA的比例分別為90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%和 10%[27]。

分別提取125 mg、100 mg、75 mg、50 mg 和25 mg杏仁和花生基因組DNA，提取方法參照1.3.1所述方法，不同質(zhì)量的樣本均按比例添加各試劑。通過對(duì)樣本提取率的計(jì)算，可從DNA水平推算到原料水平。根據(jù)公式1，計(jì)算各樣本的提取率T。

式中：T為提取率；mDNA為提取的樣本總DNA量；m為樣本質(zhì)量。

對(duì)不同質(zhì)量的杏仁和花生提取基因組DNA時(shí)，均做三組平行試驗(yàn)，提取率見表2所示。

由表 2可知在該方法下對(duì)杏仁和花生的基因組DNA 進(jìn)行提取，所得杏仁提取率為 5.91×10-4、花生的提取率為8.81×10-4。

根據(jù)杏仁、花生的提取率和公式1進(jìn)行DNA水平到原料水平的換算，換算公式見公式2：

式中：T杏仁為杏仁提取率；mDNA杏仁為提取的杏仁樣本總DNA量；m杏仁為杏仁質(zhì)量；T花生為花生提取率；mDNA花生為提取的花生樣本總DNA量；m花生為花生質(zhì)量。

其中杏仁的提取率為5.91×10-4、花生的提取率為8.81×10-4，將二者帶入公式2得到公式3。

將DNA水平的各摻假比例換算到原料水平后的比例，見表3。

由篩選出的通用引物分別與不同水平摻假的基因組DNA模型進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增出清晰明亮條帶的樣品送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 杏仁、花生基因組DNA提取率Table 2 Extraction rate of peanut genome DNA and almond genome DNA

1 0 7 0 3 7.5 0 9 5 5 1 2.5 0 1 0 3 6 5 0.0 0 9 2 2 6 5.0 0 1 0 2 0 6 6.6 7 1 2 5 8.1 7×1 0-2 9 5 8 0 6.6 7 1 0 0 9.5 8×1 0-2 8 9 8 7 5.0 0花生1 0 5 2 8 0.0 0 6 2 1 9 0.0 0 6 1 8 1 1.2 5 7 5 8.2 4×1 0-2 6 3 1 8 3.7 5 8.8 1×1 0-2 6 0 0 6 0.0 0 3 7 5 9 5.0 0 4 1 7 4 6.6 7 5 0 8.3 5×1 0-2 4 3 9 7 5.0 0 4 3 6 7 0.0 0 2 3 0 4 2.5 0 2 4 2 4 5.8 3 2 5 9.7 0×1 0-2 2 7 4 4 7.5 0 2 2 2 4 7.5 0

表3 DNA水平到原料水平換算和引物ITS2-2、trnH-psbA-1檢測(cè)結(jié)果Table 3 Conversion of DNA level to raw material level and test results of primes ITS2-2 and trnH-psbA-1

結(jié)果見表3，由表3可知用引物ITS2-2檢測(cè)摻入90%及以下花生基因組DNA(85.80%及以下花生原料)時(shí)測(cè)序結(jié)果為杏仁，雖然該引物與單一一個(gè)物種均能擴(kuò)增成功，但摻假后對(duì)花生的檢測(cè)靈敏度低，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是杏仁較花生對(duì)該引物競(jìng)爭(zhēng)性更強(qiáng)，該引物更容易與杏仁進(jìn)行擴(kuò)增；

用引物trnH-psbA-1檢測(cè)摻入10%及以上花生基因組 DNA (6.94%及以上花生原料)時(shí)測(cè)序結(jié)果為花生，說明此引物對(duì)花生檢測(cè)的靈敏度高，即對(duì)杏仁產(chǎn)品中摻入花生原料時(shí)檢出限為 6.94%，可用于對(duì)杏仁產(chǎn)品中花生源性成分的檢測(cè)。為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，采用引物ITS2-2、trnH-psbA-1二者組合作為通用引物使用，提高結(jié)果的可信度。

2.5 采樣進(jìn)行檢測(cè)及分析

對(duì)采集的 11個(gè)不同批次杏仁露待測(cè)樣品進(jìn)行基因組DNA的提取，以真核生物18S rRNA基因?qū)μ崛〉男尤事痘蚪MDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖11，由圖可知各樣品均發(fā)生起跳，且Ct值<30.0，說明樣品基因組DNA符合PCR擴(kuò)增要求。

分別以引物ITS2-2、trnH-psbA-1與提取的杏仁露基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，無菌雙蒸水做空白對(duì)照[17]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖12～13。

由圖12～13可知11個(gè)樣品與兩對(duì)引物分別擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，其中樣品2～11與引物trnH-psbA-1擴(kuò)增兩個(gè)條帶，其余樣品均擴(kuò)增出一個(gè)條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行雙向測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果。測(cè)序結(jié)果見表4。

由表4可知引物ITS2-2、trnH-psbA-1與各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果一致，其中樣品2～11檢測(cè)結(jié)果均為杏仁，說明這幾個(gè)批次杏仁露沒有摻假與產(chǎn)品標(biāo)示相符。樣品1檢測(cè)結(jié)果均為花生，與產(chǎn)品標(biāo)示不符，屬于欺瞞消費(fèi)者行為。

分析產(chǎn)生這種結(jié)果可能有以下原因：不同品牌的杏仁露加工工藝不同，對(duì)原料的破壞程度不同，使得在相同方法下提取的基因組DNA有所差異；不同批次的產(chǎn)品均一性不好；所測(cè)杏仁露中不含杏仁源性成分或者含量極少，添加了其他成分代替杏仁露的口感或者摻雜了除杏仁和花生外的其他物種欺瞞消費(fèi)者。

圖11 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)提取的杏仁露基因組DNA結(jié)果Fig.11 Almond genome DNA by real time fluorescence PCR

圖12 引物ITS2-2對(duì)不同杏仁露樣品DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.12 PCR result of primer ITS2-2 in different almond juice

圖13 引物trnH-psbA-1對(duì)不同杏仁露樣品DNA擴(kuò)增的結(jié)果Fig.13 PCR result of primer trnH-psbA-1 in different almond juice

表4 采樣產(chǎn)品鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of samples

3 結(jié)論

3.1 隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，在植物界的研究范圍越來越廣，目前有一些應(yīng)用較多的基因序列，如ITS、matK、rbcL和trnH-psbA等，但仍未達(dá)到成熟階段。本試驗(yàn)針對(duì)杏仁和花生兩個(gè)物種，通過參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫下載的10對(duì)引物分別對(duì)它們進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中有兩對(duì)引物ITS2-2、trnH-psbA-1對(duì)它們的擴(kuò)增成功率與測(cè)序成功率較高，可作為通用引物使用。

3.2 目前對(duì)于植物蛋白飲料鑒定真?zhèn)蔚南嚓P(guān)技術(shù)報(bào)道較少，該類產(chǎn)品因加工工藝導(dǎo)致難以用常規(guī)的分類學(xué)手段辨別，而利用植物DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用到此類食品的檢測(cè)上，可有效地辨識(shí)出所含物種。本試驗(yàn)?zāi)M人為在杏仁中摻入花生，利用引物ITS2-2檢測(cè)摻入90%及以下花生基因組DNA (85.80%及以下花生原料)時(shí)測(cè)序結(jié)果為杏仁；用引物trnH-psbA-1檢測(cè)摻入10%及以上花生基因組 DNA(6.94%及以上花生原料)時(shí)測(cè)序結(jié)果為花生，可將二者結(jié)合應(yīng)用于杏仁露產(chǎn)品中花生源性成分摻假的檢測(cè)。

3.3 本試驗(yàn)雖找到兩對(duì)引物，但對(duì)于某些含杏仁、花生源性成分很低的產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度仍然不夠，有待繼續(xù)研究，找到靈敏度更高的通用引物。同時(shí)二者作為過敏原對(duì)于某些人群來說誤食將有損身體健康，該研究也可為相關(guān)食品檢測(cè)其中的過敏原成分提供一定的理論基礎(chǔ)。

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