顧靜 王付亮 王來群 劉保國 周萌 苗國英 李小靜

453400河南長垣，河南宏力醫(yī)院皮膚科（顧靜、王來群）；河北醫(yī)科大學研究生學院（王付亮）；河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科（劉保國、周萌、苗國英、李小靜）

皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）發(fā)病原因主要與過量紫外線照射所致DNA損傷、修復功能紊亂以及宿主免疫耐受狀態(tài)有關。目前，鱗癌的治療多采用常規(guī)手術、激光、冷凍和放療等方法直接去除或破壞腫瘤組織。氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）已用于治療皮膚癌和癌前病變，其具體作用機制有待深入研究。蛋白激酶D1（PKD1）是鈣離子/鈣調蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D家族中最重要的一員，參與調控細胞內多條信號傳導通路，調節(jié)一系列細胞生物學行為，對維持表皮平衡發(fā)揮著重要的作用［1?4］。PKD1基因（PRKD1）位于人類染色體14qll位置，在多種惡性腫瘤組織中表達異常，其中包括黑素瘤、基底細胞癌等［5?8］。我們前期［9］實驗也證實，其在皮膚鱗癌組織中明顯高表達，且表達強度隨著鱗癌組織惡性程度的增高而增強。本研究觀察ALA?PDT對人皮膚鱗癌細胞株A431 PKD1及其磷酸化位點的影響，探討PKD1是否在光動力療法中發(fā)揮作用。

材料和方法

一、主要試劑及儀器

鹽酸ALA外用散（ALA粉劑）（上海復旦張江生物醫(yī)藥有限公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胰酶、無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK?8）（日本同仁化學研究所）；AnnexinV?FITC/PI雙染法凋亡試劑盒（美國BD公司）；RIPA強效裂解液、BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；濃縮型兔抗人PKD1多克隆抗體、酪氨酸位點Tyr463磷酸化PKD1（pTyr463）多克隆抗體、絲氨酸位點S916磷酸化PKD1（pSer916）單克隆抗體，滴度分別為1∶500、1∶1 000、1∶5 000（英國abcam公司）；二抗（山羊抗兔，北京中杉金橋生物技術有限公司）。其余試劑和耗材均由河北工程大學醫(yī)學院中心實驗室提供。LED?IB光動力治療儀（武漢亞格光電技術有限公司）、核酸蛋白檢測儀（英國Therno scientific公司）、ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：A431細胞株購自中國科學院上海細胞庫，接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2恒溫孵育箱中，每24～48小時換液，2～3 d當細胞增殖到80%～90%融合成片的單層細胞時，取對數生長期細胞按1∶2傳代接種。

2.預實驗：取對數生長期A431細胞，將ALA粉劑溶入DMEM培養(yǎng)基中，配置成終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的ALA溶液，對數生長期細胞用胰酶消化后制成2×105/ml的細胞懸液，每孔100 μl接種到96孔板，置于溫箱內培養(yǎng)24 h后，隨機分為4組，每組9個復孔，棄原培養(yǎng)基，分別加入以上4種濃度的DMEM?ALA溶液，避光孵育3 h后接受波長632 nm、總能量分別為1、2、3 J/cm2的光動力治療（每組ALA劑量所對應的各能量組均設3個復孔），24 h后行細胞增殖-毒性檢測，實驗重復3次取均值。篩選最佳的光照劑量和ALA濃度組合用于實驗。

3.實驗分組及干預：取對數生長期細胞隨機分ALA?PDT組、ALA組、單純光照組（PDT組）及對照組（不進行ALA或PDT處理）。ALA組和ALA?PDT組培養(yǎng)基加入ALA溶液，PDT組與對照組加入等體積的培養(yǎng)基，各組均避光孵育4 h后，更換培養(yǎng)基后備用。

4.CCK?8法檢測細胞活力：按照上述方法將各組細胞予以相應處理后分別繼續(xù)孵育12、24、36、48 h，每一時間點設8個復孔，以僅有培養(yǎng)基作為對照，周圍一圈加等體積無菌PBS。向每孔加入10 μl CCK?8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A值）。得到的A值去掉最大值和最小值，其余取均值計算細胞的增殖抑制率（IR）。IR=［1-（處理后A值-培養(yǎng)基A值）/（處理前A值-培養(yǎng)基A值）］×100%。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：收集各組對數生長期A431細胞，以5×105/ml接種于6孔板，2 ml/孔，待細胞貼壁后，用不含血清DMEM同步化24 h，按照方法3分組給予最佳的光照劑量和ALA濃度組合干預后培養(yǎng)24 h，每組設3個復孔，按照凋亡試劑盒說明書操作，檢測各組細胞凋亡率，實驗重復3次取均值。

6.反轉錄PCR測定ALA?PDT后不同時間點PRKD1 mRNA的表達：收集ALA?PDT作用于細胞后0、6、12、24、36、48 h的A431細胞，依照Total RNA 提取試劑說明書提取RNA。核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度后按照試劑盒要求的條件合成cDNA，所得反轉錄產物采用ABI 7500型熒光定量PCR儀擴增，引物及內參照由寶生物工程（大連）有限公司合成，PRKD1：正向引物 5′?ATGCAGCTTTCATGTATC CACCA?3′，反向引物 5′?GCATTCCAGCTCTCGCAA ATCTA?3′，產物177 bp；內參照GAPDH：正向引物5′?AGAAGGCTGGGGCTCATTTG?3′，反向引物 5′?AGGGGCCATCCACAGTCTTC?3′，產物 258 bp。計算mRNA的相對表達量（△△Ct），△Ct=Ct（PRKD1）-Ct（GAPDH），△△Ct=2?△Ct，每組重復3次取均值。

7.Western印跡法測定各組細胞中PKD1及其磷酸化位點的蛋白表達：收集每組細胞各1×107個，用RIPA裂解緩沖液提取蛋白，以BCA法測定并計算樣品蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，清洗后置于5%脫脂奶粉液中室溫封閉。加一抗于4℃過夜后加二抗，避光條件下?lián)u床振蕩1 h，清洗后應用凝膠成像分析系統(tǒng)采圖，ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH作為內參，目的條帶與內參照的灰度比值為蛋白相對表達量，各組實驗重復3次取均值。

8.統(tǒng)計學分析：用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數據用x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析與兩因素方差分析，用SNK?q檢驗進行組間多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同濃度ALA與照射能量下ALA?PDT對A431細胞增殖的影響

不同濃度ALA與照射能量下，ALA?PDT對A431細胞增殖抑制率間差異有統(tǒng)計學意義（F=41.49，P＜ 0.05），ALA濃度為1.5 mmol/L、光照劑量為2 J/cm2時的增殖抑制率高于其他濃度與光照劑量組（均P＜0.05）。見表1。

二、CCK?8法檢測4組細胞不同孵育時間對增殖的影響

經處理的4組A431細胞孵育不同時間后的增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（F=39.56，P＜0.05）。孵育24 h時，ALA?PDT組細胞增殖抑制率高于其他3組（均P＜0.05）。ALA?PDT組細胞孵育24 h的增殖抑制率高于12 h（P＜ 0.05），與36、48 h增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見圖1。

三、流式細胞儀檢測結果

經相應干預后24 h，對照組、ALA組、PDT組、ALA?PDT組細胞凋亡率分別為（4.67±0.88）%、（7.02 ± 1.52）%、（8.37 ± 0.59）%、（41.92 ± 3.23）%，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=16.32，P＜0.05），ALA?PDT組高于其他3組（均P＜0.05）。見圖2。

四、ALA?PDT后不同孵育時間點對PRKD1 mRNA表達的影響

ALA?PDT作用于A431細胞后0、6、12、24、36、48 h，細胞PRKD1 mRNA的相對表達量組間差異有統(tǒng)計學意義（F=22.24，P＜0.05），孵育后24 h低于孵育后0、6、12 h（均P＜ 0.05），與36、48 h 的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見圖3。

五、ALA光動力療法對A431細胞中PKD1及其不同位點磷酸化的影響

對照組、ALA組、PDT組、ALA?PDT組A431細胞中pSer916表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PKD1和pTyr463表達量差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），ALA組、PDT組PKD1、pTyr463的相對表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而ALA?PDT組細胞中PKD1、pTyr463的表達低于對照組、ALA組、PDT組（均P＜0.05）。見表2。

表1 A431細胞經不同濃度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光動力療法處理后24 h增殖抑制率（%，±s）

表1 A431細胞經不同濃度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光動力療法處理后24 h增殖抑制率（%，±s）

注：n=6。a與相同ALA濃度不同照射能量組比較，P＜0.05；b與相同照射能量不同ALA濃度組比較，P＜0.05

ALA濃度（mmol/L）0.5 1.0 1.5 2.0照射劑量1 J/cm2 9.25±0.24 15.23±0.24 18.30±0.53 22.05±1.01 2 J/cm2 11.08±0.65 24.68±0.52 46.26±1.25ab 29.27±0.57 3 J/cm2 17.42±0.52 25.00±0.91 29.49±0.23 25.25±1.28

圖1 氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）作用于A431細胞的時間-增殖抑制率曲線圖

討 論

圖3 氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）作用A431細胞后蛋白激酶D1 mRNA的表達 與24 h組相比，a：P＜0.05；b：P＞0.05

表2 氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）作用于A431細胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位點Y463（pTyr463）與磷酸化絲氨酸位點S916（pSer916）相對表達量（±s）

表2 氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）作用于A431細胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位點Y463（pTyr463）與磷酸化絲氨酸位點S916（pSer916）相對表達量（±s）

注：n=3。a與對照組、ALA組、PDT組比較，均P ＜0.05

組別對照組ALA組PDT組ALA?PDT組F值P值蛋白激酶D1 2.15±0.33 1.96±0.41 2.05±0.16 0.88±0.14a 10.04＜0.05 pTyr463 1.02±0.25 0.85±0.36 1.01±0.07 0.46±0.06a 8.27＜0.05 pSer916 0.64±0.03 0.60±0.04 0.62±0.03 0.40±0.02 1.53＞0.05

圖2 各組A431細胞接受相應干預24 h后流式AnnexinⅤ/PI雙染法檢測結果 2A：對照組；2B：僅氨基酮戊酸組；2C：僅光動力照射組；2D：氨基酮戊酸光動力照射組

皮膚鱗癌作為角質形成細胞來源的皮膚腫瘤，其發(fā)生與角質形成細胞增殖和分化的失衡密切相關，有研究證實，PKD1在角質形成細胞的增殖及分化過程中發(fā)揮重要作用［10］。PKD1促進細胞有絲分裂的機制尚不清楚。長期紫外線輻射損傷是皮膚鱗癌形成的主要因素之一，相關實驗證實，中波紫外線通過Tyr463位點激活細胞中的PKD1，有助于已經遭受紫外線引起的角質形成細胞DNA突變繼續(xù)擴散，甚至形成皮膚腫瘤［11］。

ALA?PDT是由光能激發(fā)光敏劑后引起光化學反應，選擇性殺傷腫瘤組織而不破壞正常的組織結構，對周邊正常組織損傷小，不產生瘢痕，可重復多次治療［12?13］。我們的實驗發(fā)現，PKD1及pTyr463在A431細胞中高表達，經ALA光動力作用后水平明顯降低，甚至原本表達較低的pSer916變的更低，而單純ALA組和單純光照組與對照組相比無明顯差異。推測PKD1在A431細胞中可能是通過Tyr463位點活化而促進癌變的發(fā)展，同時也提示PKD1可能參與ALA?PDT誘導鱗癌細胞凋亡的進程。

ALA?PDT療法近年越來越多地運用于皮膚腫瘤的治療，UVB在損傷角質形成細胞且激活PKD1的同時誘導活性氧（ROS）的產生［11］，而ALA?PDT療法正是利用選擇性聚集于腫瘤組織中的光敏劑，在一定波長的光激發(fā)下，發(fā)生一系列光化學反應，產生大量單態(tài)氧和活性氧自由基，從而殺傷腫瘤細胞。Zhang等［14］的相關研究揭示，PKD1參與線粒體去極化，是調節(jié)活性氧產生閾值的關鍵因素。我們在臨床治療中發(fā)現，ALA?PDT治療24 h內部分皮損局部出現紅斑、水腫及輕度糜爛等現象，并伴有忍受范圍內的灼熱感、癢感或者輕微疼痛，一般經冷敷或其他相應處理后約2 d可自行消退，這可能和ALA引起的光敏作用有關［15］。我們的實驗顯示，經ALA?PDT作用24 h時A431細胞的增殖抑制率和凋亡率達到最高，同時PRKD1 mRNA的表達較治療前明顯降低，36、48 h與其相比沒有明顯差別（均P＜0.05）。這種時相上的同步，提示PKD1可能參與ALA?PDT療法中的光化學反應進程，具體機制值得進一步研究。

［1］Rozengurt E.Protein kinase D signaling:multiple biological functions in health and disease［J］.Physiology（Bethesda）,2011,26（1）:23?33.doi:10.1152/physiol.00037.2010.

［2］Wille C,Seufferlein T,Eiseler T.Protein kinase D family kinases:roads start to segregate［J］.Bioarchitecture,2014,4（3）:111?115.doi:10.4161/bioa.29273.

［3］Choudhary V,Olala LO,Kaddour?Djebbar I,et al.Protein kinase D1 deficiency promotes differentiation in epidermal keratinocytes［J］.J Dermatol Sci,2014,76（3）:186 ?195.doi:10.1016/j.jdermsci.2014.09.007.

［4］Ellwanger K,Hausser A.Physiological functions of protein kinase Din vivo［J］.IUBMB Life,2013,65（2）:98 ?107.doi:10.1002/iub.1116.

［5］Sundram V,Chauhan SC,Jaggi M.Emerging roles of protein kinase D1 in cancer［J］.Mol Cancer Res,2011,9（8）:985 ?996.doi:10.1158/1541?7786.MCR?10?0365.

［6］Liou GY,Storz P.Protein kinase D enzymes:novel kinase targets in pancreatic cancer［J］.Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2015,9（9）:1143?1146.doi:10.1586/17474124.2015.1069706.

［7］Wei N,Chu E,Wipf P,et al.Protein kinase d as a potential chemotherapeutic target for colorectal cancer［J］.Mol Cancer Ther,2014,13（5）:1130?1141.doi:10.1158/1535?7163.MCT?13?0880.

［8］Ristich VL,Bowman PH,Dodd ME,et al.Protein kinase D distribution in normal human epidermis,basal cell carcinoma and psoriasis［J］.Br J Dermatol,2006,154（4）:586?593.doi:10.1111/j.1365?2133.2005.07073.x.

［9］顧靜,劉保國,周萌,等.蛋白激酶D1及其磷酸化位點在皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病及光線性角化病組織中的表達［J］.中華皮膚科雜志,2017,50（4）:247?251.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.004.

［10］Ernest DM,Ristich VL,Ray S,et al.Regulation of protein kinase D during differentiation and proliferation of primary mouse keratinocytes［J］.J Invest Dermatol,2005,125（2）:294?306.doi:10.1111/j.0022?202X.2005.23780.x.

［11］Arun SN,Kaddour?Djebbar I,Shapiro BA,et al.Ultraviolet B irradiation and activation of protein kinase D in primary mouse epidermal keratinocytes［J］.Oncogene,2011,30（13）:1586?1596.doi:10.1038/onc.2010.540.

［12］徐世正,王秀麗,張春榮.δ?氨基酮戊酸光動力療法治療皮膚基底細胞癌和鱗狀細胞癌［J］.中華皮膚科雜志,1999,32（3）:185.doi:10.3760/j.issn:0412?4030.1999.03.023.

［13］李黎波,李文敏,項蕾紅,等.光動力療法在中國的應用與臨床研究［J］.中國激光醫(yī)學雜志,2012,21（05）:278?307.

［14］Zhang T,Sell P,Braun U,et al.PKD1 protein is involved in reactive oxygen species?mediated mitochondrial depolarization in cooperation with protein kinase Cδ（PKCδ）［J］.J Biol Chem,2015,290（16）:10472?10485.doi:10.1074/jbc.M114.619148.

［15］Jin ZH,Miyoshi N,Ishiguro K,et al.Photodynamic therapy based on combined use of 5?aminolevulinic acid with a pheophorbide?a derivative for murine tumors［J］.In Vivo,2000,14（4）:529?533.