韓樂 劉本 陳賢燕 蔣雨辰 鄧文佳 萬苗堅(jiān)510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科

已有研究表明，中藥何首烏、女貞子、甘草等均對(duì)毛發(fā)生長有較明顯的促進(jìn)作用［1?2］，其中甘草酸類藥物如甘草酸苷、甘草酸二銨治療斑禿具有顯著的療效［3］?，F(xiàn)有研究表明，甘草酸苷可通過抑制斑禿患者Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)從而發(fā)揮治療效果［4］，甘草酸二銨則可通過減少脫毛小鼠毛囊細(xì)胞的損傷來促進(jìn)毛發(fā)生長［5］。甘草酸二銨作為中藥甘草的第3代提取物，具有抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜、改善肝功能等作用［6］，而對(duì)毛發(fā)生長的作用機(jī)制尚不十分明確。我們采用不同濃度甘草酸二銨培養(yǎng)人毛囊來探討其對(duì)人毛囊生長的作用，為開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。同時(shí)通過免疫熒光對(duì)毛囊增殖情況以及Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估，為進(jìn)一步闡明甘草酸二銨調(diào)控毛發(fā)生長作用的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）材料：

1.標(biāo)本來源：人頭皮標(biāo)本取自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)及廣州市粵秀整形醫(yī)院植眉手術(shù)中廢棄的枕部或額頂部頭皮。共5例，其中男2例，女3例，年齡34±9.0（23～48）歲。供皮區(qū)頭皮正常完整，毛發(fā)生長正常，無感染、脫發(fā)等其他毛發(fā)疾病。本研究通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者均簽署知情同意書。

2.主要試劑與儀器：甘草酸二銨（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、配制的Williams E無血清培養(yǎng)基［美國Gibco公司，各成分終濃度：谷氨酰胺2 mmol/L、4?羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）2 mmol/L、氫化可的松10 μg/L、牛胰島素10 mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白10 mg/L、亞硒酸鈉10 μg/L、青霉素1× 105μg/L、鏈霉素100 mg/L］。鼠抗人ki67抗體（1∶100）、兔抗人β連環(huán)蛋白（1∶500）、糖原合成激酶3β（GSK3β，1∶500）、p?GSK3β（1∶100）、淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1（lef1，1∶500）抗體，山羊抗兔熒光二抗（1∶500），山羊抗鼠熒光二抗（1∶500）均為英國Abcam公司產(chǎn)品。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗熒光淬滅封片劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。牛血清白蛋白（BSA，北京索萊寶科技有限公司）。

（二）方法：

1.毛囊分離與培養(yǎng)：將術(shù)中切下的廢棄頭皮（3cm×0.5cm）浸入生理氯化鈉溶液并置于冰上保存，離體4 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。首先用生理氯化鈉溶液洗凈頭皮，然后轉(zhuǎn)入含2%雙抗（青/鏈霉素）磷酸鹽緩沖液（PBS）中漂洗2 min，再轉(zhuǎn)入含1%雙抗的PBS溶液中漂洗兩遍，各2 min。在解剖顯微鏡下依次將頭皮分為粗胚、細(xì)胚及單株毛囊。小心切除毛囊周圍脂肪組織，真皮組織，在毛囊真、表皮連接處切斷毛囊。選取結(jié)構(gòu)完整的生長期毛囊進(jìn)行培養(yǎng)。全程冰上操作。

用顯微鑷將已分離的毛囊小心轉(zhuǎn)移至每孔含有500 μl Williams E培養(yǎng)基的24孔板中，每孔1根。倒置顯微鏡下觀察毛囊形態(tài)并拍照，測量初始長度并記錄。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后選取生長長度在0.3mm左右的毛囊進(jìn)行分組培養(yǎng)。每組15根，分別加入含有甘草酸二銨濃度為 0.1 μmol/L、0.01 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L 的Williams E培養(yǎng)基中，并設(shè)置不添加甘草酸二銨的Williams E培養(yǎng)基組為對(duì)照組。每天觀察毛囊生長形態(tài)，拍照并記錄長度。

2.免疫熒光技術(shù)評(píng)估毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞增殖情況：將培養(yǎng)第10天的毛囊固定于4%甲醛中，沿毛囊縱軸進(jìn)行石蠟包埋，切成厚度為3 μm石蠟切片數(shù)片。選取結(jié)構(gòu)完整切片二甲苯脫蠟2次，梯度乙醇水化各5 min，過水后置于乙二胺四乙酸（EDTA）修復(fù)液（pH=9）中高壓抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS清洗3遍，滴加30 μl 5%BSA稀釋后的ki67一抗覆蓋組織，4℃孵育過夜。PBS洗滌玻片3次后，滴加相對(duì)應(yīng)稀釋后的二抗30 μl，室溫避光孵育1 h。PBS清洗3次后加入10 μl DAPI避光孵育10 min，PBS過水后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.免疫熒光技術(shù)檢測毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞中Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路分子表達(dá)情況：選取3例標(biāo)本，每例收集3根毛囊，按照免疫熒光技術(shù)評(píng)估毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞增殖情況的方法，依次滴加相應(yīng)比例稀釋后的β連環(huán)蛋白、GSK3β、p?GSK3β、Lef1一抗及相對(duì)應(yīng)的二抗，同樣的方法進(jìn)行觀察并采集圖像。用Image J軟件將所獲取圖片轉(zhuǎn)為灰度圖，測量毛母質(zhì)灰度值，即吸光度值，以代表熒光強(qiáng)度，每種分子重復(fù)檢測3次，用半定量的方法比較各組吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以此來評(píng)判各組Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子β連環(huán)蛋白、GSK3β、p?GSK3β和Lef1的表達(dá)差異。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。各組毛囊生長長度數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子平均吸光度值的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較均采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.毛囊生長速度：每天換液并測量毛囊生長長度，可以見到各組毛囊生長良好，表現(xiàn)為毛干明顯伸出毛囊頂端，在一定時(shí)間內(nèi)各組毛囊生長長度均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加。與對(duì)照組相比，各濃度甘草酸二銨培養(yǎng)組毛囊毛干延伸長度均有所增加，以0.01 μmol/L組最為明顯，見圖1。如圖1所示，不同組毛囊不同時(shí)間毛干生長長度可看作一般線性模型。重復(fù)測量方差分析顯示，不同濃度甘草酸二銨對(duì)毛囊生長促進(jìn)作用不同，即組別因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.011，P＜0.05）；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，毛囊生長長度也逐漸增加，即時(shí)間因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=388.978，P＜0.05）；藥物濃度與培養(yǎng)時(shí)間不存在交互作用（F=2.09，P＞0.05），即各濃度甘草酸二銨對(duì)毛囊生長的促進(jìn)作用隨時(shí)間的變化趨勢相同。采用LSD法進(jìn)行兩兩多重比較，0.01 μmol/L甘草酸二銨毛囊生長長度顯著長于對(duì)照組（P＜0.05），而其余各組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.毛囊形態(tài)改變：可以觀察到，對(duì)照組及0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組毛囊在培養(yǎng)第6天出現(xiàn)毛母質(zhì)變細(xì)，真皮乳頭形態(tài)更加橢圓，黑素減少以及毛囊不同程度的彎曲扭折，開始進(jìn)入退行期早期，而0.01μmol/L濃度組直至培養(yǎng)第10天仍未出現(xiàn)較明顯的退行改變，見圖2。

3.毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞增殖：免疫熒光顯示，ki67主要表達(dá)于毛母質(zhì)細(xì)胞核中，核內(nèi)ki67陽性分子被染成紅色（圖3A～3E，白色箭頭所指核內(nèi)紅色熒光）。如圖3所示，與對(duì)照組相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L濃度組毛母質(zhì)細(xì)胞中ki67陽性細(xì)胞均較多，0.000 1 μmol/L濃度組無明顯差異。

4.毛母質(zhì)細(xì)胞中Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各分子表達(dá)：如圖4所示，β連環(huán)蛋白、GSK3β、p?GSK3β主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈綠色熒光，而Lef1集中表達(dá)于細(xì)胞核中，也表現(xiàn)為綠色熒光，各分子在各組毛囊中均有不同程度表達(dá)。單因素方差分析顯示，β連環(huán)蛋白、p?GSK3β、Lef1在各組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.604、16.65、15.266，均P＜0.05），而GSK3β在各組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.472，P＞ 0.05）。LSD?t檢驗(yàn)顯示，0.1、0.01、0.001μmol/L甘草酸二銨組毛母質(zhì)細(xì)胞中β連環(huán)蛋白、p?GSK3β、Lef1平均吸光度值均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.05），而0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組這3個(gè)分子與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

圖1 不同濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊生長長度（mm）0.01 μmol/L 甘草酸二銨組與對(duì)照組、0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組相比，顯著延長毛干生長長度

圖2 各濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊10 d的形態(tài)（×40） 0.01 μmol/L甘草酸二銨組與對(duì)照組、0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組相比，毛囊生長期顯著延長

圖3 各濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊中ki67表達(dá)（×200） 3A：對(duì)照組；3B：0.1 μmol/L甘草酸二銨組；3C：0.01 μmol/L甘草酸二銨組；3D：0.001 μmol/L甘草酸二銨組；3E：0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組；與對(duì)照組相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二銨組毛母質(zhì)細(xì)胞中ki67陽性細(xì)胞均明顯增多，0.000 1 μmol/L甘草酸二銨組無明顯變化

圖4免疫熒光觀察不同濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子的表達(dá)（×200） 與對(duì)照組相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二銨組毛母質(zhì)細(xì)胞中β連環(huán)蛋白、p?GSK3β、Lef1表達(dá)量增多，GSK3β在各組中的表達(dá)量均無明顯差異

表1 各濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子表達(dá)情況（平均吸光度值，±s）

表1 各濃度甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛囊Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各主要分子表達(dá)情況（平均吸光度值，±s）

注：均n=3；0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二銨組毛母質(zhì)細(xì)胞中β連環(huán)蛋白、p?GSK3β、Lef1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（均P＜0.05）

甘草酸二銨濃度（μmol/L）0（對(duì)照組）0.1 0.01 0.001 0.000 1 F值P值β連環(huán)蛋白0.045 0±0.002 8 0.063 0±0.002 8 0.067 5±0.005 0 0.064 5±0.006 4 0.042 0±0.005 7 12.604 0.008 GSK3β 0.028 0±0.004 2 0.032 5±0.005 0 0.032 0±0.004 2 0.034 0±0.001 4 0.023 0±0.008 5 1.472 0.336 p?GSK3β 0.040 0±0.002 8 0.059 5±0.002 1 0.059 5±0.006 4 0.055 5±0.002 1 0.037 5±0.003 5 16.65 0.004 Lef1 0.021 0±0.004 2 0.036 5±0.002 1 0.042 5±0.003 5 0.041 5±0.002 1 0.024 5±0.005 0 15.266 0.005

三、討論

毛囊具有周期性循環(huán)的自我更新系統(tǒng)，經(jīng)歷生長期、退行期、休止期的不斷循環(huán)而完成毛發(fā)的生長與更新［7］。自毛囊發(fā)育成熟以來，一組含有強(qiáng)增殖能力的毛母質(zhì)細(xì)胞群在生長期的不斷增殖分化使得毛干延長［8］。因此，促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖，延長毛囊生長期，對(duì)毛囊生長具有重要意義。

劉維等［9］發(fā)現(xiàn)，甘草甜素及甘草次酸具有腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，可促進(jìn)毛發(fā)生長，甘草次酸還可抑制小鼠生殖腺產(chǎn)生睪酮，對(duì)治療雄激素性脫發(fā)有利，甘草酸二銨作為甘草有效成分的第3代提取物，同樣具備這些作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的毛囊中，0.01 μmol/L甘草酸二銨具有較明顯促進(jìn)毛囊生長作用，且從培養(yǎng)第4天開始表現(xiàn)出此作用，說明甘草酸二銨發(fā)揮促毛囊生長作用不僅與藥物濃度有關(guān)，也與藥物作用時(shí)間相關(guān)。毛囊進(jìn)入退行期的典型形態(tài)改變包括毛母質(zhì)變細(xì)，真皮乳頭形態(tài)更加橢圓以及黑素減少，毛干呈杵狀，毛囊出現(xiàn)彎曲扭折［10］，我們發(fā)現(xiàn)，0.01 μmol/L甘草酸二銨能明顯推遲毛囊進(jìn)入退行期。

毛母質(zhì)細(xì)胞中ki67分子的表達(dá)是評(píng)估毛囊增殖活性的重要指標(biāo)，生長期表達(dá)增多而退行期表達(dá)減少。免疫熒光結(jié)果顯示，0.01 μmol/L甘草酸二銨體外培養(yǎng)的毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，更加驗(yàn)證了0.01μmol/L甘草酸二銨有促毛囊生長及延長生長期的作用，而較高0.1 μmol/L濃度及較低0.001μmol/L、0.0001μmol/L濃度的甘草酸二銨沒有表現(xiàn)出這兩種作用。雖然0.1 μmol/L濃度及0.001 μmol/L濃度組毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞與對(duì)照組相比仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖活性，這僅說明甘草酸二銨可促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞增殖，而只有適宜濃度的甘草酸二銨才能發(fā)揮最明顯的促進(jìn)毛囊生長及延長毛囊生長期的作用。濃度過高可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用［11］，而過低則未達(dá)到起效濃度。章建華等［5］發(fā)現(xiàn)，高劑量甘草酸二銨可促進(jìn)脫毛小鼠毛發(fā)生長，而低劑量組未見明顯作用，證實(shí)其發(fā)揮作用確實(shí)是與藥物濃度相關(guān)。

毛囊能夠?qū)崿F(xiàn)生長與周期調(diào)控的重要先決條件是表皮與其下間質(zhì)之間分子學(xué)信號(hào)的交流［12］，其中最主要的是Wnt/β連環(huán)蛋白經(jīng)典信號(hào)途徑及骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長因子β（BMP/TGF?β）信號(hào)通路。Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活時(shí)，誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)入生長期，促進(jìn)毛發(fā)生長，而BMP信號(hào)通路激活則加速毛囊退行，抑制其生長，兩者相互拮抗來調(diào)控毛囊生長周期［13?14］。當(dāng)Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路被激活時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)GSK3β被磷酸化失活，胞質(zhì)β連環(huán)蛋白水平升高，此后被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核內(nèi)，促進(jìn)核內(nèi)Lef分子的表達(dá)并與DNA結(jié)合蛋白Lef/Tcf家族成員結(jié)合，形成一個(gè)活化的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的生長［15］。本研究結(jié)果顯示，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二銨體外培養(yǎng)毛母質(zhì)細(xì)胞中β連環(huán)蛋白、p?GSK3β、Lef1表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，提示一定濃度甘草酸二銨可能通過激動(dòng)Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，使胞質(zhì)β連環(huán)蛋白表達(dá)增多，GSK3β磷酸化，使得p?GSK3β增多，進(jìn)一步促進(jìn)核內(nèi)Lef1表達(dá)，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，最終實(shí)現(xiàn)毛囊生長期的延長及毛發(fā)生長。此外，雖然0.1及0.001 μmol/L濃度組毛囊中Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路各分子表達(dá)量增加，但最終并未表現(xiàn)出促進(jìn)毛發(fā)生長及延長生長期的作用，不排除有其他信號(hào)通路參與此作用，如對(duì)毛囊生長有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的BMP信號(hào)通路。綜上所述，0.01 μmol/L甘草酸二銨可促進(jìn)人體外毛囊生長，延長生長期，且有可能通過激活Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路而發(fā)揮此作用。

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