張思敏， 李吉方， 溫海深， 呂里康， 李蘭敏， 趙 吉

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué)), 山東青島 266003)

魚類是水生低等變溫脊椎動(dòng)物，容易受外界環(huán)境的影響。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中溫度、鹽度、酸堿度等因素是影響魚類生長(zhǎng)的主要脅迫因子[1]。溫度直接影響到魚類的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、代謝、存活等生命過(guò)程。溫度的劇烈波動(dòng)是魚類在養(yǎng)殖、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中極易遭遇到的一種環(huán)境脅迫[2]。魚類血液生理生化與環(huán)境條件、生理狀況等密切相關(guān)。當(dāng)魚體受到外界因子影響時(shí)，必定會(huì)在血液指標(biāo)中反映出來(lái)，因此血液指標(biāo)被廣泛用來(lái)評(píng)價(jià)魚類健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況和對(duì)環(huán)境適應(yīng)狀況[3-4]。

轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝和蛋白質(zhì)、脂肪與糖類三者相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程中有極重要的地位，其中以谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)最重要[5]。AST和ALT是聯(lián)系糖類、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，AST起催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用, ALT起催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用。正常情況下，AST 和ALT 主要存在于肝臟中，只有少量被釋放到血漿中，血清中的ALT 活性較小。因此，魚類血清AST和ALT的活性可以被用作監(jiān)測(cè)魚體的健康狀況的指標(biāo)[6,7]。堿性磷酸酶(ALP) 是一種在生物界中分布廣泛的磷酸酯酶，是生物體的一種重要的代謝調(diào)控酶，可直接參與生物機(jī)體磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機(jī)體磷的代謝、維持體內(nèi)鈣磷比例等作用，為ADP 磷酸化形成ATP 提供所需的無(wú)機(jī)磷酸[8-9]。

AST、ALT和LDH均是血清肝臟代謝酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶基因(GOT1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因(GPT1)和乳酸脫氫酶基因(LDH)均在肝臟中表達(dá)[10]。在肝臟受到損傷時(shí)，AST和ALT被釋放進(jìn)入血液,所以它們?cè)谘褐械幕钚钥梢杂脕?lái)估計(jì)肝損程度。LDH是無(wú)氧糖酵解代謝酶，魚類受到應(yīng)激，在機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)后LDH參與乳酸代謝的氧化還原反應(yīng)。然而,GOT1、GPT1和LDH的表達(dá)水平也可以反映它們的其他功能,如能量代謝變化和代謝改變[11-12]。本研究探討了在魚類受到應(yīng)激時(shí)，機(jī)體代謝發(fā)生改變，相關(guān)代謝酶的活性發(fā)生變化是否有基因調(diào)控參與。

本文從組織學(xué)層面分析了急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉(Sebastesschlegelii)肝臟的影響以及肝臟中GOT1、GPT1和LDH表達(dá)水平的變化情況，同時(shí)探討了急性溫度脅迫下許氏平鲉血清中2種轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)、血液生理生化指標(biāo)，旨在探究許氏平鲉對(duì)急性溫度脅迫的生理適應(yīng)及響應(yīng)機(jī)制，豐富魚類環(huán)境生理學(xué)內(nèi)容，為魚類養(yǎng)殖與運(yùn)輸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用許氏平鲉于2015年11月采自山東省青島市黃島區(qū)沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體。挑選30尾健康活潑，無(wú)傷無(wú)病，發(fā)育良好的個(gè)體(體質(zhì)量為(610.4±15.7)g，體長(zhǎng)為(27.3±1.5)cm)用于實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)在0.6 m3圓柱形塑料白桶中，每桶放置10尾，在室溫16 ℃下暫養(yǎng)24 h。

實(shí)驗(yàn)設(shè)急性低溫(5 ℃)脅迫組、急性高溫(27 ℃)脅迫組和室溫(16 ℃)對(duì)照組。暫養(yǎng)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)分為3組，每組10尾，分別轉(zhuǎn)移到預(yù)先設(shè)置好的溫度梯度環(huán)境中。12 h后采集所有實(shí)驗(yàn)魚的待測(cè)樣品。

1.2 樣品采集

采樣前將實(shí)驗(yàn)魚放入MS-222麻醉劑(200 mg/L) 中麻醉。先進(jìn)行尾靜脈采血并制備血清和抗凝血分別用于血液生理生化和血細(xì)胞分析，然后迅速解剖實(shí)驗(yàn)魚，取新鮮的肝臟組織迅速于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆茫蝗〔糠中迈r肝臟組織用波恩溶液(Bouins)24 h固定后轉(zhuǎn)存于70%酒精。

1.3 石蠟組織切片及觀察

肝臟組織經(jīng)過(guò)Bouins固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，LEICA-RM201切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，展片，烘干，蘇木精-伊紅染色(H.E染色)，中性樹脂封片，晾干。置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 血液樣本分析

采用BS-180全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞，深圳)測(cè)定血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，堿性磷酸酶(ALP)和乳糖脫氫酶(LDH)的活性以及血糖(GLU)的含量。采用BS-1800全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞，深圳)對(duì)采集的抗凝血樣品進(jìn)行檢測(cè)與分析。所有檢測(cè)試劑盒均采購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.5 總RNA的提取和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

運(yùn)用Trizol法的相應(yīng)步驟提取總RNA，使用核酸測(cè)定儀測(cè)定提取后每個(gè)樣品總RNA的濃度，以備反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TAKARA，日本)進(jìn)行去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄。在RNase-free分子管中加入總RNA0.5～1.0 μL(根據(jù)所得到的RNA濃度計(jì)算而定)，分別加入gDNA Eraser，5×gDNA Eraser Buffer，補(bǔ)加RNase free H2O使分子管中混合液體的總體積達(dá)到10 μL。在PCR儀中42 ℃反應(yīng),2 min之后立即在冰塊上加入反轉(zhuǎn)錄試劑。加入上一步反應(yīng)體系、RNase free H2O、RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I、5×PrimeScript Buffer2分別為10、4、1、1、4μL，反應(yīng)體系為20μL。在PCR儀中37 ℃，15 min、85 ℃，5 s反應(yīng)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 GPT1、GOT1、LDH相對(duì)表達(dá)量的分析

根據(jù)許氏平鲉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI：SRR4409372)得到的GOT1、GPT1和LDH的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，其序列見表1。設(shè)計(jì)成功的引物由華大基因Oligo進(jìn)行合成。

表1 基因表達(dá)分析的特異性引物

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒為SYBR Premix Ex TaqTM(TAKARA，日本)。對(duì)樣品cDNA 進(jìn)行4倍梯度稀釋，以稀釋后的cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR Premix Ex Taq10 μL、上、下游引物各0.4 μL、cDNA模板2.0 μL、ddH2O 6.8 μL。上機(jī)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s、95 ℃下變性5s，相應(yīng)基因退火溫度下退火30 s，72 ℃下延伸40 s，40個(gè)循環(huán)以后，從退火溫度以每30 s 0.4 ℃的增長(zhǎng)直至95 ℃。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，以18 S為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因以及18 S的Ct值，按照2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并采用Duncan多重檢驗(yàn)法對(duì)各組間進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)分析。利用Excel(2007版)和SigmaPlot13.0繪制圖表。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性溫度脅迫對(duì)肝臟組織的影響

對(duì)照組肝臟組織中肝細(xì)胞為多邊形，排列整齊有序，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核明顯呈圓形(見圖1B)。高溫脅迫組肝臟損傷較為明顯，肝細(xì)胞排列無(wú)序、較多肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞間界限雜亂模糊、細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解(見圖1A)。低溫脅迫組肝臟組織損傷并不明顯，無(wú)明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，肝細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核明顯呈圓形，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻(見圖1C)。高溫脅迫組與對(duì)照組相比肝臟組織破損較為嚴(yán)重，而低溫脅迫組與對(duì)照組相比肝臟組織的變化并不明顯。高溫可能使肝臟受到了較嚴(yán)重的損傷，低溫對(duì)肝臟的損傷并不明顯。

2.2 急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉血液指標(biāo)的影響

由表2可知，高溫脅迫組(27 ℃)與對(duì)照組(16 ℃)相比，除了平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)變化不顯著，其他指標(biāo)均出現(xiàn)顯著性變化。其中平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)顯著下降(P<0.05)，從16 ℃時(shí)的368.71 g/L下降到27 ℃時(shí)的282.78 g/L。而白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積 (MCV)、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)等指標(biāo)均顯著上升。

(A：高溫脅迫組(27 ℃)，B：對(duì)照組(16 ℃)，C：低溫脅迫組(5 ℃)(×400)。比例尺=20μm。A: Thermal treatment (27 ℃). B: Control treatment (16 ℃). C: Cold treatment (5 ℃(×400)). Scale=20μm.)

圖1 不同溫度脅迫下許氏平鲉肝臟組織學(xué)變化

注：*表示顯著性差異(P<0.05)。

Note:*indicates significant difference (P<0.05).

①Low temperature (5 ℃)；②Normal temperature (16 ℃)；③Hightemperature (27 ℃)

低溫脅迫組(5 ℃)與對(duì)照組(16 ℃)相比，白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)顯著下降(P<0.05)，分別從16 ℃時(shí)的138.57×109/L和58.73 fL下降到5 ℃時(shí)的128.60×109/L和 50.37 fL。平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)顯著上升(P<0.05)，由16 ℃時(shí)的368.71 g/L下降到5 ℃時(shí)的401.78 g/L。其他指標(biāo)無(wú)顯著性變化。

2.3 急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉血清指標(biāo)的影響

由圖2A可知，在高溫脅迫下許氏平鲉血清中ALT、AST和ALP的水平分別由16 ℃時(shí)的11.54、34.92和46.16 U/L上升到27 ℃時(shí)的33.30、112.03和85.84 U/L，且差異顯著(P<0.05)。LDH變化并不顯著。在低溫脅迫下，ALP和LDH的水平顯著下降(P<0.05)，分別由16 ℃時(shí)的46.16和102.38 U/L下降到5 ℃時(shí)的15.62和52.58 U/L。而ALT和AST的水平與對(duì)照組相比有所下降，但并不顯著。急性溫度脅迫下許氏平鲉血清中GLU的水平在低溫和高溫脅迫下均顯著上升(P<0.05)，由16 ℃時(shí)0.97 mmol/L分別上升到5 ℃時(shí)3.29 mmol/L、27 ℃時(shí)6.14 mmol/L，并且高溫脅迫比低溫脅迫的GLU水平上升較顯著(見圖2B)。

(A：急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉血清中ALT、AST、ALP以及LDH水平的影響；B：急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉血清中GLU水平的影響。圖中標(biāo)注的小寫字母表示同一指標(biāo)在不同溫度之間存在顯著性差異(P<0.05)。Effect of acute temperature stress on ALT、 AST、 ALP、 LDH (A) and serum GLU (B) inSebastesschlegelii.Different small letters indicate significant differencesin different temperature of the same index (P<0.05).)

圖2 急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉血清中代謝酶及葡萄糖水平的影響

Fig.2 Effect of acute temperature stress on metabolic enzymes and serum GLU inSebastesschlegelii

2.4 急性溫度脅迫對(duì)肝臟中GOT1、GPT1和LDH mRNA表達(dá)的影響

低溫組和高溫組GOT1 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。處理組GPT1 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。低溫組LDHmRNA的表達(dá)水平相比于對(duì)照組幾乎不變，但高溫組有所上升，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

(圖中標(biāo)注的小寫字母表示同一指標(biāo)在不同溫度之間存在顯著性差異(P<0.05)。Different small letters indicate significant differencesin different temperature of the same index (P<0.05).)

圖3 急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉肝臟中GOT1、GPT1和LDHmRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

Fig.3 Effect of acute temperature stress on the expression level ofGOT1、GPT1 andLDHmRNA in the liver ofSebastesschlegelii

3 討論

肝臟是魚體內(nèi)較大的組織器官，是維持生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝的重要器官之一。大量研究表明，當(dāng)肝臟受到損傷后主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核偏移，嚴(yán)重的導(dǎo)致細(xì)胞核溶解、細(xì)胞破損、細(xì)胞間界線模糊等[13]。Liu B等[14]對(duì)團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)高溫處理48 h后，與對(duì)照組相比，肝臟細(xì)胞細(xì)胞核偏移到細(xì)胞邊緣，細(xì)胞質(zhì)流失，細(xì)胞核萎縮并呈多邊形，表明高溫導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受損。Salazar-Lugo R等[15]對(duì)大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)進(jìn)行溫度處理后，高溫29 ℃的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常、核溶解，部分區(qū)域細(xì)胞壞死；低溫18 ℃的肝臟組織出現(xiàn)空泡化，表明高溫和低溫會(huì)導(dǎo)致肝臟會(huì)受到不同程度的損傷。本研究表明，高溫27 ℃時(shí)，肝臟損傷較為明顯，肝細(xì)胞排列雜亂、較多肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞間界限雜亂模糊、細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解，而低溫5 ℃時(shí)，與對(duì)照組相比，肝臟組織損傷并不明顯。高溫使肝臟受到了較嚴(yán)重的損傷，低溫對(duì)肝臟的損傷并不明顯，這表明許氏平鲉不耐高溫，較耐低溫,高溫使肝臟損傷較為嚴(yán)重。

在血液中WBC、HGB、RBC等，常被作為評(píng)價(jià)魚類應(yīng)激狀況的輔助指標(biāo)。而在魚類血液中RBC和HGB主要是受水溫的影響。魚類血液中WBC是參與機(jī)體免疫的重要成分。魚體受到急性溫度脅迫后，血液中WBC的數(shù)量發(fā)生改變，標(biāo)志著機(jī)體免疫機(jī)能的改變[16-17]。黃姻等[18]研究表明，隨溫度降低，羅非魚(Oreochromisniloticus)血液的HGB、MCH和MCHC均明顯升高，12 ℃時(shí)RDW-CV顯著下降。MCHC和RDW-CV與本研究結(jié)果一致。溫海深等[19]研究表明，在高溫27 ℃處理2h,6h后許氏平鮋HGB和RBC呈先上升后下降的趨勢(shì)，WBC顯著上升。在本研究中，高溫27 ℃處理12h后，MCHC顯著下降，許氏平鮋血液中WBC、HGB、RBC、HCT、MCV、RDW-CV、RDW-SD等指標(biāo)均顯著上升。HGB和RBC顯著升高，可能是由于當(dāng)水溫升高時(shí)，魚類新陳代謝增強(qiáng)，并且運(yùn)動(dòng)加劇，對(duì)氧的消耗量增加，導(dǎo)致了HGB和RBC上升。WBC顯著上升，可能是由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)高溫應(yīng)激應(yīng)答的結(jié)果。低溫5 ℃處理12h后，隨著溫度的降低，WBC和RDW-SD顯著下降，MCHC顯著上升，其他指標(biāo)變化不明顯，說(shuō)明許氏平鲉對(duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性，而不耐高溫，高溫時(shí)血液中大多數(shù)指標(biāo)出現(xiàn)顯著性差異。

血清中AST和ALT活性是檢測(cè)肝臟功能是否正常的重要指標(biāo)。正常生理代謝條件下， AST和ALT只有少量被釋放到血漿中，因此，血清中AST和ALT活性較小[20]。但當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境脅迫，如溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，可能造成機(jī)體損傷，尤其會(huì)造成正常的肝臟細(xì)胞受損，導(dǎo)致肝臟中的AST和ALT被釋放至血液中影響機(jī)體正常的代謝功能。ALP能夠直接參與調(diào)節(jié)磷代謝，為ADP磷酸化形成ATP提供更多所需的無(wú)機(jī)磷酸。LDH是參與糖酵解酶的重要酶，也是公認(rèn)的組織損傷的潛在標(biāo)記[21-22]。Dalvi R S等[23]研究表明，在高溫33和36 ℃時(shí)，短體下眼鲿(Horabagrusbrachysoma)血清中ALT、AST和LDH的活性隨溫度的升高而升高，與對(duì)照組26 ℃相比，差異顯著(P<0.05)，在高溫36 ℃時(shí)， ALP的活性比對(duì)照組26 ℃也升高。這與本研究結(jié)果基本一致。在本研究中，高溫27 ℃時(shí)，血清中ALT和AST的活性顯著上升，可能是由于魚體受到脅迫，引起肝臟受損，細(xì)胞內(nèi)的AST和ALT被釋放到血液中，導(dǎo)致血液中這2種酶的活性顯著升高。27 ℃時(shí)，ALP的活性顯著升高，5 ℃時(shí)，ALP的活性顯著下降。ALP是一種重要的代謝調(diào)控酶，其活性主要受溫度的影響。魚類處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，將影響血清中ALP活性[24]。因此，許氏平鲉體內(nèi)代謝受了到溫度脅迫的影響。27 ℃時(shí)，LDH活性也有所上升，5 ℃時(shí)，LDH活性顯著下降，說(shuō)明糖代謝途徑也受到了溫度脅迫的影響。在應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝方面以血糖的變化為主要指標(biāo)[25]。在Lermen C L等[26]研究中，鯰魚(Rhamdiaquelen)血清中血糖在高溫31 ℃時(shí)升高，在低溫15 ℃時(shí)降低。而在本研究中，高溫27 ℃和低溫5 ℃時(shí)，血糖水平均顯著升高。魚類受到溫度脅迫時(shí)，一方面可能由于交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)被調(diào)動(dòng)起來(lái)，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以利于應(yīng)急時(shí)重要器官得到更多的血液供應(yīng)；另一方面由于機(jī)體為了抵抗溫度應(yīng)激，以適應(yīng)在應(yīng)激情況下對(duì)能量的需要，加快了糖的利用，糖異生作用加強(qiáng)，血糖含量不斷上升，使葡萄糖含量超過(guò)正常水平[27-29]。

Edgar A D[30]等研究表明，ALT和AST廣泛用于組織損傷過(guò)程中血清標(biāo)記，其中基因調(diào)控也是在增加血清轉(zhuǎn)氨酶的活性的一個(gè)重要因素。然而在本研究中，GOT1、GPT1和LDHmRNA的表達(dá)水平雖然有所變化，但均不顯著(P>0.05)。這表明血清中ALT、AST和LDH的活性變化并沒有受到基因表達(dá)的調(diào)控，同時(shí)進(jìn)一步證明，血清中ALT和AST活性的上升是由于高溫使肝臟受到了損傷，肝組織中的ALT和AST進(jìn)入到了血清中，而非由于基因表達(dá)水平上升造成了血清中ALT和AST活性上升。

4 結(jié)語(yǔ)

急性溫度脅迫對(duì)許氏平鲉肝臟代謝和血液生理生化指標(biāo)產(chǎn)生了一定影響。各項(xiàng)結(jié)果表明，許氏平鲉對(duì)高溫脅迫更敏感，較耐低溫，養(yǎng)殖適宜溫度范圍為18～24 ℃，建議在養(yǎng)殖和運(yùn)輸過(guò)程中，盡量避免高溫對(duì)許氏平鲉的脅迫。

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