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肝癌細(xì)胞HepG2與QGY7701攝取99Tcm-AMD3100與18F-FDG的對比研究

2018-03-16 02:27:26何婷婷王卉田嘉禾張錦明
關(guān)鍵詞:示蹤劑小室探針

何婷婷,王卉,田嘉禾,張錦明*

1.解放軍總醫(yī)院海南分院核醫(yī)學(xué)科,海南三亞 572013;2.解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100853; *通訊作者 張錦明zhangjm301@163.com

原發(fā)肝癌的早期診斷、治療和治療后的及時(shí)隨訪對提高患者的生存率有非常重要的意義。近年來PET/CT顯像在肝癌診斷中得到廣泛應(yīng)用,其中廣譜類的腫瘤顯像劑主要是18氟-氟代脫氧葡萄糖(18F-fluoro-2-deoxyglucose,18F-FDG),其腫瘤攝取和治療后預(yù)后相關(guān)[1]。然而PET顯像費(fèi)用昂貴不易普及。而相對廉價(jià)的單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(single-photon emission computed tomography,SPECT)在肝癌診斷上尚無理想的腫瘤顯像劑。趨化因子受體-4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白家族的一員,與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1,SDF-1),也稱C-X-C motif chemokine 12(CXCL12)相互作用后啟動(dòng)下游信號通路形成 SDF-1/CXCL12/CXCR4生物軸,在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[2]。本文擬通過99Tcm標(biāo)記的CXCR4特異性拮抗劑AMD3100,對2株肝癌細(xì)胞HepG2和QGY7701的攝取特征進(jìn)行初步研究,并與18F-FDG進(jìn)行比較,以探討99Tcm-AMD3100 SPECT顯像能否在體評估肝癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá),并幫助判別肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

1 材料與方法

1.199Tcm-AMD3100與18F-FDG的制備與質(zhì)量控制AMD3100由Sigma公司提供,采用配體轉(zhuǎn)移法,先制備99Tcm-GH(MDP)等中間轉(zhuǎn)移配體,再由AMD3100與之競爭以制備最終產(chǎn)品。標(biāo)記完畢后將示蹤劑的比活度稀釋調(diào)整為3.7~7.4 MBq/0.5 ml備用。放化純>90%方可使用。18F-FDG由解放軍總醫(yī)院放射性藥物合成中心提供,依照說明書制備和質(zhì)量控制。制成比活度為 3.7~7.4 MBq/0.5 ml(37 GBq/L)的18F-FDG溶液備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人類肝癌細(xì)胞株HepG2與QGY7701(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)在含10%的優(yōu)級胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中(PAA公司),于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。硝酸纖維素膜購自普利來基因技術(shù)有限公司;RT-PCR試劑盒購自Promega公司;AMD3100購自Sigma公司。

1.3 細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 將Matrigel放在冰上然后放入冰箱中隔夜使其解凍,與無血清DMEM按1∶1混合,取24孔板,每孔加入40 μl,置37℃使其凝聚成膠狀。遷移實(shí)驗(yàn)中濾膜無需鋪膠,余步驟與Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)相同。在24孔板中加入含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,將細(xì)胞懸液加入Transwell小室中,每小室200 μl,每種細(xì)胞重復(fù)3孔,將小室浸于24孔板的完全培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,取出小室,去掉上層小室中的培養(yǎng)液,并用棉棒仔細(xì)去除上層小室側(cè)的未遷移細(xì)胞和Matrigel。小室外側(cè)細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用PBS清洗3遍。鏡下觀察遷移杯底面細(xì)胞。在顯微鏡下拍照。用33%醋酸脫色,將結(jié)晶紫完全洗脫下來,洗脫液可在酶標(biāo)儀上562 nm測其OD值,間接反映細(xì)胞數(shù)。

1.4 肝癌細(xì)胞CXCR4mRNA水平檢測 根據(jù)GenBank中CXCR4 cDNA的序列設(shè)計(jì)引物,上游引物:5’-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3’,下游引物:5’-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3’,產(chǎn)物大小為302 bp。內(nèi)參照GAPDH:上游引物:5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’,下游引物:5’-CCACTGACACGTTGGCAGTG-3’,產(chǎn)物大小為275 bp。取對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞,采用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA,用RNase-freeDNase I處理后進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)體系:模板1 μl;上游引物1 μl;下游引物1 μl;2×Tag PCR MasterMix 12.5 μl;H2O 9.5 μl;總體積25 μl。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用凝膠圖像掃描儀拍照并用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析,以CXCR4/GAPDH的比值代表其相對表達(dá)量,每個(gè)條帶測量3次。

1.5 體外肝腫瘤細(xì)胞99Tcm-AMD3100攝取實(shí)驗(yàn) ①將2株肝癌細(xì)胞分別接種于6孔板,待細(xì)胞生長至80%左右,實(shí)驗(yàn)前更換新鮮培養(yǎng)基。取示蹤劑用PBS液稀釋,PBS液用量根據(jù)計(jì)數(shù)進(jìn)行調(diào)整,取稀釋后示蹤劑液30~100 μl加入空白小試管中,置入井型γ-計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù),使計(jì)數(shù)穩(wěn)定在100 000以下。分別孵育30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min,每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。②每組孵育結(jié)束時(shí),培養(yǎng)孔用PBS洗滌細(xì)胞3次,0.25%胰酶消化2 min,用1.5 ml含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化。③收集全部細(xì)胞懸液放入小管中,γ-計(jì)數(shù)器測定每個(gè)小管中細(xì)胞的放射性計(jì)數(shù)并記錄,計(jì)算每1×106個(gè)細(xì)胞的放射性活度,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。④數(shù)據(jù)校正計(jì)算公式。細(xì)胞攝取率計(jì)算:%ID/106=實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)/空白管計(jì)數(shù)×100%/細(xì)胞計(jì)數(shù)(單個(gè)細(xì)胞的示蹤劑攝取量與加入示蹤劑總量的比值)。方法同上計(jì)算2株細(xì)胞對18F-FDG的攝取。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件,計(jì)量資料均以±s表示,比較采用方差分析或t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2株肝癌細(xì)胞體外遷移及侵襲能力比較 遷移實(shí)驗(yàn)中見較多HepG2細(xì)胞和QGY7701細(xì)胞穿越濾膜,鏡下顯示HepG2穿越細(xì)胞數(shù)多于QGY7701,HepG2的 OD 值(1.243±0.100)高于 QGY7701(1.170±0.155),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);侵襲實(shí)驗(yàn)中見部分細(xì)胞穿越基質(zhì)膠和濾膜,HepG2的 OD值(0.433±0.025)高于 QGY7701(0.347±0.032),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 肝癌細(xì)胞 CXCR4mRNA 水平檢測 HepG2、QGY7701肝癌細(xì)胞系均存在CXCR4mRNA水平的表達(dá)(圖1),相對表達(dá)量分別為 0.888±0.048、0.786±0.027,HepG2細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)明顯高于QGY7701,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 HepG2和QGY7701細(xì)胞的CXCR4mRNA表達(dá)水平,*P<0.05

2.3 2株肝癌細(xì)胞99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率比較 2株肝癌細(xì)胞對于99Tcm-AMD3100及18F-FDG的攝取率見表1、2,99Tcm-AMD3100在2株肝癌細(xì)胞中攝取率呈波動(dòng)式上升。18F-FDG的攝取率均隨時(shí)間的延長而持續(xù)增加。2株肝癌細(xì)胞在15 min、30 min、60 min及360 min時(shí),HepG2的99Tcm-AMD3100攝取率高于QGY7701,其中60 min攝取率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而在120 min及180 min時(shí),QGY7701的99Tcm-AMD3100攝取率高于 HepG2,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min 6個(gè)時(shí)間點(diǎn),HepG2的18F-FDG攝取率均高于QGY7701,其中30 min、120 min及150 min時(shí)2株細(xì)胞18F-FDG的攝取率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。2株細(xì)胞對18F-FDG攝取較快,攝取率更高,而99Tcm-AMD3100的攝取率偏低,且2株細(xì)胞間變化較小。同一株細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)18F-FDG的攝取率均高于99Tcm-AMD3100,其中120 min和180 min時(shí),HepG2細(xì)胞中18F-FDG 的攝取率明顯高于99Tcm-AMD3100,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),而在30 min和120 min時(shí),QGY7701細(xì)胞中18F-FDG的攝取率明顯高于99Tcm-AMD3100,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖2。

3 討論

表1 2株肝癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)99Tcm-AMD3100攝取率的比較(n=3)

表2 2株肝癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)18F-FDG攝取率的比較(n=5)

圖2 18F-FDG及99Tcm-AMD3100在HepG2或QGY7701細(xì)胞中攝取率的比較,*P<0.05

趨化因子主要參與調(diào)節(jié)感染、炎癥以及組織修復(fù)相關(guān)的免疫反應(yīng),并且在胚胎形成階段調(diào)控多種細(xì)胞的遷移。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)46種趨化因子和18種趨化因子受體[3]。其中 CXCR4屬于特異性趨化因子受體,在多種不同類型腫瘤中均有表達(dá),在侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2,4-5]。有研究表明,CXCR4高表達(dá)的腫瘤病情進(jìn)展快且預(yù)后不良,在 CXCL12/CXCR4表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)的腫瘤研究中,高表達(dá)CXCL12的組織形成的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶是此類腫瘤患者的主要死亡原因[6-7]。而AMD3100作為強(qiáng)效、選擇性非肽類趨化因子CXCR4受體拮抗劑,能與SDF-1競爭結(jié)合CXCR4,能抑制大多數(shù)惡性腫瘤,對腫瘤起治療作用。研究表明,金屬離子Cu2+、Zn2+等與AMD3100絡(luò)合后其與CXCR4的親和性提高了數(shù)十倍,這為AMD3100用于廣譜類惡性腫瘤顯像提供了可能[8];但64Cu本身會(huì)分解聚集于肝臟內(nèi)造成肝臟本底攝取增高。因此本研究選擇99Tcm-AMD3100作為CXCR4受體顯像劑。該示蹤劑具備高靶本比的同時(shí),肝臟攝取明顯減低,適用于腫瘤CXCR4受體的活體化研究[9]。既往CXCR4受體探針的研究主要集中在藥代動(dòng)力學(xué)、藥物體外生物學(xué)分布及毒性試驗(yàn)方面[8-9]。經(jīng)研究證實(shí),CXCR4高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞及動(dòng)物模型能特異性攝取CXCR4探針;還有部分研究將該類探針用于某些腫瘤(如小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)活體顯像,發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達(dá)的活體腫瘤組織均存在不同程度CXCR4探針的攝取,且與腫瘤組織 CXCR4表達(dá)高低有一定相關(guān)性,但部分CXCR4高表達(dá)的腫瘤無顯著放射性濃聚,考慮可能與該受體的動(dòng)力學(xué)特征及內(nèi)化有關(guān)[10-11];且該類臨床研究例數(shù)有限,同時(shí)CXCR4受體探針濃聚程度受多種因素影響,如治療方案及化療藥物等。

本研究在制備99Tcm-AMD3100的基礎(chǔ)上,選取了組織來源不同的2株肝癌細(xì)胞,通過RT-PCT法檢測CXCR4mRNA的差異性表達(dá),判斷細(xì)胞體外遷移及侵襲能力大小,同時(shí)利用99Tcm-AMD3100進(jìn)行細(xì)胞核素?cái)z取實(shí)驗(yàn),并與經(jīng)典腫瘤顯像劑18F-FDG進(jìn)行對比,研究其CXCR4的表達(dá)與細(xì)胞遷移、侵襲能力及攝取率之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明,所選2種肝癌細(xì)胞均不同程度地表達(dá)CXCR4,其mRNA表達(dá)水平與2株肝癌細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)趨勢,王勃等[12]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞其轉(zhuǎn)移潛能高于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞,提示CXCR4可能是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因子。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中CXCR4高表達(dá)的HepG2細(xì)胞,其99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率明顯高于QGY7701,提示肝癌細(xì)胞中CXCR4mRNA表達(dá)與CXCR4受體探針、18F-FDG攝取值呈正相關(guān)趨勢,與既往文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致,但同一株細(xì)胞內(nèi)99Tcm-AMD3100的攝取率明顯低于18F-FDG。Vag等[13]在研究中也發(fā)現(xiàn)同一腫瘤組織中68Ga-pentixafor(CXCR4受體探針)攝取值偏低,考慮是由于該探針結(jié)合位點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì),而通過轉(zhuǎn)錄或蛋白水平 CXCR4的表達(dá)則位于細(xì)胞表面造成,認(rèn)為CXCR4受體探針可能更適用于某些特殊類型腫瘤顯像(如多發(fā)性骨髓瘤)。盡管HepG2細(xì)胞的CXCR4mRNA表達(dá)明顯高于 QGY7701,但在不同時(shí)間點(diǎn) 2株肝癌細(xì)胞99Tcm-AMD3100攝取率高低略有不同,提示2株肝癌細(xì)胞99Tcm-AMD3100體外攝取動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與18F-FDG略有不同,而HepG2不同時(shí)間點(diǎn)的99Tcm-AMD3100平均攝取率高于QGY7701,與2株肝癌細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)呈正相關(guān)趨勢,同時(shí)侵襲力高的 HepG2細(xì)胞的99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率均高于侵襲力低的QGY7701細(xì)胞,提示99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率均可作為判定細(xì)胞侵襲力高低的指標(biāo)之一。

本研究通過不同生物學(xué)特性肝癌細(xì)胞初步觀察了99Tcm-AMD3100的體外攝取動(dòng)力學(xué)特征,并與18F-FDG進(jìn)行比較,盡管99Tcm-AMD3100體外攝取率低于18F-FDG,且隨時(shí)間變化差異較大,但2株肝癌細(xì)胞99Tcm-AMD3100攝取率與CXCR4表達(dá)及侵襲能力呈正相關(guān)趨勢,提示99Tcm-AMD3100可作為一種特異性強(qiáng)的新型腫瘤顯像劑用于肝癌研究,但本文僅從細(xì)胞水平初步評估CXCR4受體表達(dá)與相關(guān)探針的相互關(guān)系,還需通過動(dòng)物模型及活體顯像進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的相關(guān)性。

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