吳 憂，莫書(shū)榮，張 鑫（廣西醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣西南寧530021）

腫瘤是一類(lèi)常見(jiàn)且多發(fā)的疾病，是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一。根據(jù)我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析，全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病與死亡第1位均為肺癌[1]。據(jù)報(bào)告顯示，我國(guó)2015年估計(jì)有4 292 000例癌癥新發(fā)病例，2 814 000例癌癥死亡，肺癌成為最常見(jiàn)癌癥，也是癌癥死亡的首要原因[2]。

肺癌按其組織學(xué)分型有以下2種基本類(lèi)型：小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中20%的肺癌患者屬于SCLC，特點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短，進(jìn)展快，常伴內(nèi)分泌異?；蝾?lèi)癌綜合征；而另外80%的NSCLC患者中又被分成以下4種類(lèi)型：鱗癌、腺癌、腺鱗癌和類(lèi)癌，其中腺癌占肺癌的40%以上，女性多于男性，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移及血性胸腔積液。近20多年來(lái)腫瘤化療發(fā)展迅速，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。通過(guò)臨床實(shí)踐，化療對(duì)SCLC的療效無(wú)論是早期或晚期都較為肯定，甚至有根治的少數(shù)報(bào)告。化療對(duì)NSCLC也有一定療效，但僅為姑息，作用有待進(jìn)一步提高。當(dāng)前早期NSCLC的治療主要是手術(shù)治療，而中晚期腫瘤則以化療為主。而化療會(huì)抑制骨髓造血系統(tǒng)，主要是白細(xì)胞和血小板的下降，因此限制了其化療藥物的使用劑量[3]。

中藥因其獨(dú)特的抗腫瘤特性在全球范圍內(nèi)越來(lái)越引人關(guān)注，研究表明，中醫(yī)治療肺癌能減輕手術(shù)，放、化療的不良反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力和患者生活質(zhì)量[4-5]，而黃芪作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥便是其中之一。藥理實(shí)驗(yàn)及臨床報(bào)道表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等方面具有重要作用[6]。近年來(lái)通過(guò)對(duì)黃芪中的有效成分如黃芪多糖、黃芪甲苷的研究，臨床對(duì)其抗腫瘤的作用及機(jī)制更加了解。本課題組通過(guò)使用黃芪注射液作為實(shí)驗(yàn)藥物探究其對(duì)肺癌A549細(xì)胞的作用來(lái)尋找其適宜的作用濃度及時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 本科室凍存的人肺腺癌A549細(xì)胞系。

1.1.2 儀器與試劑 黃芪注射液（質(zhì)量濃度為2000mg/mL，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；RPMI-1640（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；青霉素、鏈霉素（索萊寶科技有限公司）；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，同仁公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；胰蛋白酶（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2，北京索萊寶科技有限公司）；96孔板（Corning公司）；YJ.875型醫(yī)用超凈臺(tái)（吳江市空氣凈化設(shè)備廠）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；TD6M臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）；移液槍?zhuān)‥ppendorf公司）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 0.25%胰蛋白酶溶液的配制 稱(chēng)取0.25 g胰蛋白酶粉劑和0.04 g EDTA-Na2同時(shí)溶于高壓后放涼的100 mL PBS中，待完全溶解后用過(guò)濾器過(guò)濾溶液，密封放置4℃保存，使用時(shí)取出。

1.2.2 人肺腺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基配成的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L）培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層細(xì)胞瓶后，用0.25%胰蛋白酶消化2 min后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，用巴氏吸管吹下貼壁細(xì)胞后吸入離心管，以700 r/min離心5 min后取出棄上清，加入培養(yǎng)基重懸，再分至新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)細(xì)胞并將其種于6孔板中，設(shè)對(duì)照組和不同質(zhì)量濃度（100、200、400、600、800 mg/mL）的黃芪注射液組。在細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁約為孔板底部的80%時(shí)，加入不同質(zhì)量濃度的黃芪注射液，培養(yǎng)24 h觀察細(xì)胞形態(tài)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)藥物效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×104個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔，每組設(shè)置5個(gè)副孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，用1.5 mL EP 管配制質(zhì)量濃度分別為 100、200、400、600、800 mg/mL的黃芪注射液，每孔110μL替換原有的全部培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10μL CCK-8試劑繼續(xù)混合培養(yǎng)1.5 h顯色。酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（OD）值（檢測(cè)波長(zhǎng)為 450 nm），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，匯總OD450值，計(jì)算抑制率，抑制率=[（對(duì)照組平均OD450值－實(shí)驗(yàn)組平均OD450值）/（對(duì)照組平均OD450值－空白組平均OD450值）]×100%。黃芪注射液的半數(shù)抑制濃度（IC50）采用改良寇氏法[7-8]：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，其中Xm：lg（最大劑量），I：lg（最大劑量/相臨劑量），P：陽(yáng)性反應(yīng)率之和，Pm：最大陽(yáng)性反應(yīng)率，Pn：最小陽(yáng)性反應(yīng)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總及初步處理，應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，其所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文中所用圖采用GraphPad Prism 5軟件制作。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組及100、200、400 mg/mL的黃芪注射液組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈上皮樣，多角形，核仁明顯，胞質(zhì)飽滿，邊界清晰。在600 mg/mL黃芪注射液組中，可見(jiàn)部分細(xì)胞體積變小、形態(tài)變圓，皺縮，與鄰近細(xì)胞分離，但仍有部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；在800 mg/mL黃芪注射液組中，大部分細(xì)胞變圓且失去貼壁特性，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制。見(jiàn)圖1。

圖1 各組A549細(xì)胞形態(tài)變化（20×）

2.2 黃芪注射液對(duì)A549細(xì)胞的作用 作用24 h時(shí)，100、200、400 mg/mL黃芪注射液組對(duì)細(xì)胞有促生長(zhǎng)作用，但隨著濃度的增加而減弱，600、800 mg/mL黃芪注射液組對(duì)細(xì)胞有抑制作用，且隨濃度的增加而增強(qiáng)；作用48 h時(shí)，作用效果大致與24 h相同；而作用72 h后，400 mg/mL黃芪注射液組不再具有促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，600、800 mg/mL黃芪注射液組的抑制作用增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。作用 24、48 h 后，100、200、800 mg/mL 黃芪注射液組與對(duì)照組的OD450值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；作用 72 h 后，100、200、400、600、800 mg/mL 黃芪注射液組與對(duì)照組的OD450值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 黃芪注射液作用肺癌A549細(xì)胞的IC50計(jì)算 根據(jù)改良寇氏法計(jì)算 24、48、72 h 的 IC50分別為 776、851、616 mg/mL，作用48 h時(shí)，黃芪注射液對(duì)A549細(xì)胞有明顯的促生長(zhǎng)作用，而在72 h時(shí)，黃芪注射液對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。

圖2 不同質(zhì)量濃度黃芪注射液作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

表1 各組作用不同時(shí)間A549細(xì)胞OD450值的比較（±s）

表1 各組作用不同時(shí)間A549細(xì)胞OD450值的比較（±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)間比較，aP＜0.05；與同組72 h比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組黃芪注射液質(zhì)量濃度（mg/mL）100 200 400 600 800作用時(shí)間（h）24 0.342±0.023 48 0.342±0.023 72 0.664±0.063 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.835±0.074a 0.782±0.089a 0.551±0.057a 0.436±0.062a 0.378±0.041a

3 討 論

肺癌是全世界目前惡性腫瘤死亡的首要原因，放、化療方案因其確切的療效一直是NSCLC臨床治療的首選，但其對(duì)人體血液系統(tǒng)有不良反應(yīng)。在我國(guó)，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤歷史悠久，并且中醫(yī)藥治療肺癌有自己獨(dú)特的理論體系和確切療效，中西醫(yī)學(xué)互為補(bǔ)充、相互交融的模式成為肺癌治療發(fā)展的方向與趨勢(shì)[9]，黃芪也因其抗腫瘤的特性備受關(guān)注。

本研究通過(guò)用黃芪注射液作用A549細(xì)胞觀察其細(xì)胞形態(tài)的變化和增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其在低濃度和短時(shí)間時(shí)對(duì)A549細(xì)胞有促生長(zhǎng)的作用，加大濃度及延長(zhǎng)作用時(shí)間能顯著增強(qiáng)黃芪注射液對(duì)A549細(xì)胞的明顯抑制作用。不同于黃芪單一活性成分的研究，如黃芪多糖[10]、黃芪甲苷[11]，均具有明顯A549細(xì)胞抑制作用，而對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用未在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液在低濃度、短作用時(shí)間時(shí)對(duì)A549細(xì)胞具有促生長(zhǎng)作用，其抑制作用在高濃度、長(zhǎng)作用時(shí)間時(shí)顯著。黃芪化學(xué)成分復(fù)雜，目前研究已經(jīng)證實(shí)主要含有多糖、黃酮、皂苷及氨基酸等活性物質(zhì)[12]。而腫瘤細(xì)胞自身不能合成氨基酸，所以其生長(zhǎng)增殖所需皆需從外界獲取。本實(shí)驗(yàn)中所用黃芪注射液中含有多種氨基酸，可能對(duì)肺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生一定的促生長(zhǎng)作用。

另就計(jì)算得出的黃芪注射液對(duì)肺癌A549細(xì)胞的IC50而言（計(jì)算得出作用細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為776、851、616 mg/mL），其濃度先升后降，初步可以得出，黃芪注射液作用A549細(xì)胞需要較高濃度及更長(zhǎng)的作用時(shí)間才能達(dá)到較好的抑制效果。而如果需要得出更精確的、能適用于臨床治療的IC50仍需進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)探索驗(yàn)證。

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