徐旖旎，趙玲璐，肖一佳，陶玲，沈祥春，張彥燕

(1貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴陽550025；2貴州醫(yī)科大學(xué)中藥藥理學(xué)教研室)

心肌纖維化是心肌成纖維細胞(CFs)異常增殖轉(zhuǎn)化并分泌大量膠原蛋白，病理性細胞外基質(zhì)積聚[1]，引起心肌膠原纖維過量聚集且膠原比例失衡，最終引起心肌纖維化。大量研究資料證實心肌纖維化是惡性心血管事件的獨立高危因素[2]，因此，研究抑制CFs異常增殖的藥物對心肌纖維化的治療具有重要的意義。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是最強的促纖維化因子[3]，能夠促進CFs膠原分泌、細胞外基質(zhì)積聚[4]。在TGF-β信號通路中，Smads蛋白是信號通路下游主要效應(yīng)分子，TGF-β受體與配體結(jié)合后通過磷酸化Smad蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，促進纖維化發(fā)展[5]。氧化苦參堿(OMT)是豆科槐屬植物苦參的主要有效成分，具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗肝纖維化和腎纖維化等作用。前期研究證實，OMT對醛固酮誘導(dǎo)的CFs增殖模型有抑制作用[6]，對醛固酮誘導(dǎo)的心肌細胞損傷有保護作用[7]，對急性心肌梗死誘發(fā)的心肌纖維化有治療作用[8]。2014年9月～2015年6月，本實驗進一步研究OMT對TGF-β1誘導(dǎo)的體外CFs增殖模型的干預(yù)作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康1～3 d的SD大鼠500只，Ⅱ級清潔級，雌雄不限，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK(黔)2012-0001。HF90/HF240型CO2孵育箱(中國上海力申科學(xué)儀器有限公司)；BS223S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；JB-CJ-1FXS型潔凈工作臺(中國蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；DMi1倒置相差顯微鏡(德國Leica Microsystems公司)；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國GE公司)；Microfuge 20R離心機(德國Beckman Coulter公司)，垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Universal Hood Ⅱ型實時熒光定量PCR系統(tǒng)儀(美國Biorad公司)。OMT(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，批號20080210)，TGF-β1(美國Pepro Tech公司，批號0611209)，Vimentin兔單克隆抗體、Fibronection兔單克隆抗體(宜百康生物科技有限公司，批號P08670、P02751)，DAB染色試劑盒(北京康為生物科技有限公司，批號07912L)，大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維ELISA試劑盒(上海地澤生物公司，批號20582)，Smad2、Smad3 XP Rabbit mAb (Cell Signaling Technology，批號#5339、#9513)。

1.2 原代CFs的培養(yǎng)、鑒定及分組 新生大鼠用75%乙醇消毒皮膚，胸部向上，固定四肢，虹膜剪剪開胸部皮膚及肌肉，暴露心臟，更換剪刀，取下正在搏動的心臟前1/3部分，置入冷PBS洗凈殘血，轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中，剪成約1 mm3碎塊，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部，加入含10%血清的DMEM并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基慢慢浸過組織塊。培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，隔日換液。細胞長滿瓶底后傳代，用傳代后2～4代CFs進行實驗。免疫細胞化學(xué)法染色顯示細胞中有波形蛋白及纖維連接蛋白表達者可鑒定為CFs，并將CFs分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+OMT組。

1.3 CFs增殖水平檢測 采用MTT法。細胞接種、同步化同上。對照組無血清DMEM，TGF-β1組加入TGF-β120 ng/mL，TGF-β1+OMT組加入濃度為3.78×10-4mol/L OMT預(yù)處理1 h后[12]，加入最佳濃度TGF-β1(20 ng/mL)共同孵育24 h，檢測各孔A490值，以A490值反映各組CFs增殖水平。

1.4 CFsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白表達檢測 采用ELISA法。將各組藥物處理好的CFs，消化離心，用PBS制成細胞懸液，使細胞濃度達到100 萬個/mL。通過反復(fù)凍融使細胞破壞并釋放細胞內(nèi)蛋白，2 000 r/min離心20 min后按照ELISA試劑盒說明書操作并測定CFsⅠ、Ⅲ型膠原含量，膠原含量高則膠原表達多。

1.5 CFs Smad2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR，將各組藥物處理好的CFs，用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入上游及下游引物進行PCR反應(yīng)。Smad2：上游序列ACCACTCTCTCCCCTGTCAAT，下游序列CAAACCTAAGCAGAACCTCTCC，Rat actin beta：上游序列CACCCGCGAGTACAACCTTC，下游序列CCCATACCCACCATCACACC。根據(jù)2-ΔΔCt，進行Smad2 mRNA表達的相對定量分析。

1.6 CFs Smad2、Smad3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將各組藥物處理好的CFs，根據(jù)蛋白提取試劑盒提取蛋白樣本，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量后上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，1%BSA封閉1 h，按1∶1 000稀釋一抗，1∶5 000稀釋二抗，分別進行免疫蛋白印記分析，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，并以β-actin為內(nèi)參標(biāo)化各樣品蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 原代CFs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 組織塊法培養(yǎng)CFs，倒置顯微鏡下觀察，CFs 3～5 d從組織塊游出并貼壁生長，呈梭形、多角形，胞體形態(tài)飽滿，折光性強，胞質(zhì)透明，7～10 d細胞呈融合狀態(tài)，排列緊密。傳代培養(yǎng)并采用反復(fù)差速貼壁方法培養(yǎng)的CFs基本保留了原代培養(yǎng)的特點，且純度較原代細胞高。免疫細胞化學(xué)法染色后，波形蛋白染色細胞胞質(zhì)被染成棕黃色，為強陽性反應(yīng)，纖維連接蛋白染色呈強陽性，胞質(zhì)內(nèi)可見圍繞胞核呈棕黃色的細密顆粒，符合CFs染色特征，純度>99%。

2.2 各組CFs增殖情況比較 與對照組比較，給予20 ng/mL TGF-β1能明顯增加CFs的A490[(0.43±0.02) vs (0.51±0.02)，P<0.05]，提示TGF-β1誘導(dǎo)CFs增殖模型建立成功。與TGF-β1組(0.51±0.02)比較，TGF-β1+OMT組(0.42±0.04)A490顯著降低(P均<0.05)。

2.3 各組CFsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白含量比較 與對照組比較，TGF-β1組誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量明顯增加(P均<0.05)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+OMT組Ⅲ型膠原蛋白表達降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組CFs中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量比較

注:與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，△P<0.05。

2.4 各組CFs Smad2 mRNA表達比較 與對照組比較，TGF-β1組Smad2 mRNA水平明顯升高(P均<0.05)；TGF-β1+OMT組Smad2 mRNA水平(3.54±0.03)較TGF-β1組(5.62±0.02)明顯降低(P均<0.05)。

2.5 各組CFs Smad2、Smad3蛋白表達比較 與對照組比較，TGF-β1組Smad2及Smad3蛋白水平明顯升高(P均<0.05)；TGF-β1+OMT組與TGF-β1組比較，Smad2及Smad3蛋白水平表達降低(P均<0.05)。見表2。

3 討論

心肌纖維化是膠原合成與降解代謝失衡的結(jié)果，其形成機制雖不盡相同，但CFs異常增殖是最終直接導(dǎo)致心肌纖維化的重要病理基礎(chǔ)[9]。TGF-β1目前已被公認為是器官纖維化治療的主要靶標(biāo)[10]，是重要的調(diào)節(jié)細胞增殖、分化的細胞因子，有效促進細胞外基質(zhì)沉積，誘導(dǎo)CFs轉(zhuǎn)化和增生、抑制基質(zhì)降解酶活性，促進膠原蛋白異常高表達，使細胞外基質(zhì)降解與合成平衡失調(diào)，誘發(fā)心肌纖維化。Smad蛋白是TGF-β信號通路下游主要效應(yīng)分子，有證據(jù)表明，膠原合成是通過Smad信號介導(dǎo)的，而TGF-β/Smads信號通路也是被證實的TGF-β1發(fā)揮生物學(xué)作用的主要信號系統(tǒng)[11]。TGF-β受體通過磷酸化Smad蛋白從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進纖維化發(fā)展。因此，抑制TGF-β/Smads信號，可減少膠原表達，從而抑制纖維化發(fā)展。

表2 各組CFs中Smad2、Smad3蛋白表達比較

注:與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β1組比較，△P<0.05。

本研究顯示，CFs經(jīng)TGF-β1處理24 h后，A490值呈濃度依賴性增加，TGF-β1組與對照組比較，可顯著誘導(dǎo)CFs增殖。時效關(guān)系結(jié)果顯示，20 ng/mL的TGF-β1作用24 h效果最佳。由此我們可推斷，心肌纖維化與TGF-β1過度表達呈正相關(guān)。

OMT為具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)生物堿，是苦參的主要藥效成分之一。OMT在心血管系統(tǒng)具有廣泛的活性，具有強心、降壓、抗心律失常等作用。本研究顯示，TGF-β1可誘導(dǎo)CFs增殖，而OMT 3.78×10-4mol/L及7.57×10-4mol/L預(yù)處理1 h可顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)CFs的A490增加，抑制CFs增殖。由此我們可推斷，OMT對TGF-β1誘導(dǎo)CFs的增殖具有抑制作用。

細胞外基質(zhì)主要由纖維膠原網(wǎng)、基底膜、蛋白多糖和葡萄糖胺聚糖組成，還包括眾多生物活性因子，其中Ⅰ型膠原約占85%。當(dāng)心肌纖維化發(fā)生時，Ⅰ型膠原表達明顯上調(diào)，細胞外基質(zhì)沉積，基質(zhì)重構(gòu)，使心臟功能紊亂。本研究顯示，TGF-β1可誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達增加，OMT各劑量組可減少TGF-β1誘導(dǎo)的CFs增殖過程中Ⅰ、Ⅲ膠原表達的增加，與TGF-β1組比較，差異顯著，提示OMT對TGF-β1誘導(dǎo)的膠原沉積具有逆轉(zhuǎn)作用，可改善TGF-β1誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)沉積。

TGF-β/Smads信號是公認的介導(dǎo)器官纖維化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TGF-β1與受體結(jié)合后，激活Smads蛋白進入核內(nèi)，共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad蛋白作為TGF-β信號通路的下游，參與了心臟、肺臟、腎臟、肝臟的纖維化過程。研究發(fā)現(xiàn)[12]，慢性風(fēng)濕性心臟病患者瓣膜纖維化過程中TGF-β1表達增加。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，抑制TGF-β/Smads信號可改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)[14],Smad3可介導(dǎo)心肌肥厚、心肌纖維化及心功能失調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化與TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2、Smad3的磷酸化以及磷酸化的Smad2、Smad3核移位有關(guān)[15]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，OMT抑制大鼠急性心肌梗死后心肌纖維化作用與降低TGF-β/Smads促纖維形成作用，增強抑制纖維化形成作用密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1組CFs Smad2基因、Smad2、Smad3蛋白顯著增加，提示Smad2、Smad3參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。OMT可以減少Smad2 mRNA、Smad2及Smad3蛋白表達，與TGF-β1組比較，差異顯著。由此我們可以推測OMT通過抑制TGF-β1表達，減弱Smad2、Smad3蛋白水平，從而抑制TGF-β/Smads信號系統(tǒng)，減少細胞外基質(zhì)產(chǎn)生，降低膠原表達，從而產(chǎn)生抗纖維化作用。

OMT對TGF-β1誘導(dǎo)的CFs增殖具有顯著的抑制作用，其作用機制可能與抑制TGF-β/Smads信號系統(tǒng)下游調(diào)控蛋白Smad2、Smad3表達密切相關(guān)。

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