李姍，郭文杰，李呂木*，魯陳，衛(wèi)愛蓮

1(安徽農業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥，230036)2(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)

小麥酒精糟是小麥在生產酒精過程中產生的主要副產物，干物質中粗蛋白含量約占39%[1]，且含有豐富的氨基酸、維生素和多種微量元素等[2-3]，可直接飼喂動物[4]，但其含水量高達70%～85%，運輸成本高且易腐敗變質[5]。因此，通常是烘干生產小麥干酒精糟[6]，但烘干的成本較高[7]，并且高溫烘干會造成蛋白質變性[8]，導致飼用品質下降[9-10]。為克服烘干的不足，有學者對玉米酒精糟進行發(fā)酵，生產水分含量在30%左右的發(fā)酵玉米酒精糟，其真蛋白由21.54%提高到30.22%，3種重要氨基酸(蛋氨酸、賴氨酸、蘇氨酸)總含量提高了28.41%，從而使飼養(yǎng)價值得到提高[11]。大量文獻表明蛋白質飼料通過微生物發(fā)酵可提高其小肽含量[12]，增強其抗氧化活性，可改善動物的免疫功能[13-14]。但對小麥酒精糟的發(fā)酵飼用尚未見報道，為此，本研究通過混菌固態(tài)厭氧發(fā)酵小麥發(fā)酵酒精糟，以酸溶蛋白為主要考察指標，兼顧有利于提高動物適口性的pH指標和考察經濟性的發(fā)酵損耗指標，進行發(fā)酵菌種篩選，發(fā)酵條件優(yōu)化，以期獲得低水分的飼用發(fā)酵小麥酒精糟。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥酒精糟：水分74.86%，粗蛋白9.58%；次粉：水分9.69%，粗蛋白14.45%，均由安徽瑞福祥食品有限公司提供。

菌種：乳酸菌(Laobacillus)-1(M1)、乳酸菌-2(M2)、乳酸菌-3(M3)、乳酸菌-4(M4)、乳酸菌-5(R-02)、芽孢桿菌(B.subtilis)-1(N1)、芽孢桿菌-2(N2)、芽孢桿菌-3(N3)、芽孢桿菌-4(N4)、芽孢桿菌-5(KG109)、酵母菌(Saccharomyces)-1(P1)、酵母菌-2(P2)、酵母菌-3(P3)、酵母菌-4(P4)、酵母菌-5(P5)均為本實驗室保藏的飼用菌種。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，C2HCl3O2、濃H2SO4、CuSO4：分析純，西隴科學股份有限公司；NAOH：分析純，煙臺市雙雙化工有限公司；K2SO4：分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；濃HCl：分析純，上海振企化學試劑有限公司等。

1.2 儀器與設備

DGT-G135C型精密鼓風恒溫干燥箱，合肥達斯卡特科學器材有限公司；BSB224S型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；SKD-200型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；SKD-20N型智能數控消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司；YXQ·SG41·280型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測定

采用PHS-25型pH計按國標測定[15]。

1.3.2 發(fā)酵飼料水分的測定

采用恒重法測定樣品中的水分含量[16]。

1.3.3 粗蛋白質的測定

采用凱氏定氮法測定樣品中的粗蛋白質[17]。

1.3.4 酸溶蛋白的測定

采用TCA法測樣品中酸溶蛋白含量[18]。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮的測定

采用自動凱氏定氮法測揮發(fā)性鹽基氮含量[19]。

1.3.6 物料損失

比較發(fā)酵前后干物質變化，計算物料損耗。

(1)

(2)

式中：N，物料損耗，%；X1，發(fā)酵前干物質含量，%；M1，發(fā)酵前樣重，g；X2，發(fā)酵后干物質含量，%；M2，發(fā)酵后樣重，g；Z，酸溶蛋白提高量，%；E1，發(fā)酵前酸溶蛋白凈含量，g；E2，發(fā)酵后酸溶蛋白凈含量，g。

1.5 試驗方法

首先研究不同菌種對小麥酒精糟固態(tài)發(fā)酵的影響，獲得幾株優(yōu)勢菌后再研究其不同組合的發(fā)酵效果，得到最佳組合后，對發(fā)酵基質組成進行優(yōu)化，研究不同單因素(菌液接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間)對發(fā)酵效果的影響，再應用中心組合設計對3個單因素進行響應面優(yōu)化，得到3個因素的最優(yōu)組合，具體方法如下：

1.5.1 不同菌種對小麥酒精糟固態(tài)發(fā)酵的影響

先將小麥酒精糟和次粉按比例混勻，添加實驗室已有飼用菌種，攪拌均勻后，裝袋密封并稱重。發(fā)酵培養(yǎng)基成分：小麥酒精糟質量分數50%，次粉質量分數50%,菌液質量分數1%,35 ℃培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵7 d。以發(fā)酵產物中酸溶蛋白含量為考察指標，篩選出發(fā)酵效果較好的菌種。

1.5.2 不同菌種組合對小麥酒精糟固態(tài)發(fā)酵的影響

將篩選出的菌種按不同組合進行發(fā)酵，混菌發(fā)酵菌液為各菌種等比例混合，培養(yǎng)基同上。篩選出最優(yōu)的組合菌。

1.5.3 不同發(fā)酵底物組成對小麥酒精糟固態(tài)發(fā)酵的影響

小麥酒精糟含水量在75%左右，本試驗通過添加次粉來調節(jié)發(fā)酵底物的含水量，按表1中發(fā)酵底物的成分進行固體厭氧發(fā)酵，選用篩選出的組合菌種進行發(fā)酵。挑選最佳配比進行以后的混菌固態(tài)發(fā)酵試驗。

表1 發(fā)酵底物組成Table 1 Composition of the substrates

1.5.4 發(fā)酵小麥酒精糟單因素試驗

發(fā)酵底物成分和菌種組合根據單因素結果進行發(fā)酵，研究接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間在不同水平下對發(fā)酵結果的影響。單因素試驗的不同水平見表2。

表2 單因素試驗選取的不同水平Table 2 Single factor trials were selected at different levels

1.5.5 發(fā)酵小麥酒精糟響應面試驗

通過單因素試驗，采用經典的3因素3水平Box-Benhnken(BBD)試驗設計，選取接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)3個因素作為優(yōu)化條件的因素對象。以-1、0、+1代表變量水平，試驗因素和水平見表3，通過中心組合設計，以發(fā)酵后酸溶蛋白Y為響應值，重復3次。

表3 試驗設計因素水平及編碼Table 3 Design of experimental factors and codes

2 結果與討論

2.1 不同菌種對小麥酒精糟發(fā)酵效果的影響

本試驗共選取15株飼用微生物進行小麥酒精糟的單菌固態(tài)發(fā)酵試驗，發(fā)酵初始酸溶蛋白含量為0.75%，不同菌種對發(fā)酵產物酸溶蛋白的影響見表4，可見乳酸菌中R-02發(fā)酵產物中酸溶蛋白含量最高，顯著優(yōu)于其他4株乳酸菌(p<0.05)。芽孢菌中KG109發(fā)酵產物中酸溶蛋白含量最高，顯著優(yōu)于其他4株菌芽孢菌(p<0.05)。酵母菌發(fā)酵效果劣于乳酸菌及芽孢桿菌，可能是由于酵母菌分泌的蛋白酶較少，乳酸菌明顯降低了發(fā)酵飼料的pH，改善了適口性，較低的pH可抑制有害菌的生長，有利于飼料的保存。前人研究發(fā)現，不同菌株發(fā)酵效果有所不同[20]。發(fā)酵產物的酸溶蛋白都有顯著提高，表明固態(tài)發(fā)酵過程中菌株能產生蛋白酶并作用于蛋白質，將大分子蛋白質分解為動物易于吸收的酸溶蛋白[13-14]，提高產品蛋白質的品質。

表4 不同菌株對發(fā)酵結果的影響Table 4 Effects of different strains on fermentation results

注：同列數據無字母或數據肩標相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05)，不同字母表示差異顯著(p<0.05)；下表同。

2.2 不同菌種組合對小麥酒精糟發(fā)酵效果的影響

乳酸菌R-02和枯草芽孢桿菌KG109兩菌發(fā)酵效果最好，酵母菌中P1和P6發(fā)酵效果最優(yōu)?；旌暇臧l(fā)酵時不同菌株之間可能會產生協同作用，較優(yōu)于單菌發(fā)酵[21]，增強發(fā)酵效果[20]。因此，綜合考慮，選取R-02+KG109、R-02+KG109+P1、R-02+KG109+P6進行不同菌種組合發(fā)酵試驗。不同菌種組合的發(fā)酵產物中酸溶蛋白含量如表5所示，R-02+KG109雙菌組合發(fā)酵產物中酸溶蛋白含量最高，發(fā)酵效果最好，顯著高于3菌組合(p<0.05)。

混菌發(fā)酵有效地提高了酸溶蛋白的含量，這與彭慧慧等人[20]的研究結果相符。但是由于混菌發(fā)酵的總接種量與單菌發(fā)酵的一致，所以與單菌發(fā)酵相比，每種菌株的添加量反而降低，所以3菌混合發(fā)酵后的酸溶蛋白含量并沒有高于雙菌發(fā)酵的結果?？莶菅挎邨U菌可產生蛋白酶、脂肪酶等活性較高的酶，可以消除小麥酒精糟中的抗營養(yǎng)因子，同時還可以降低蛋白質的分子質量，增加酸溶蛋白的含量[22-23]。乳酸菌發(fā)酵可降低飼料pH和氨態(tài)氮的含量，提高飼料轉化率，同時產生乳酸、細菌素等多功能天然抑菌物質，從而控制大多數腐敗菌及致死菌的生長[24-25]。R-02和KG109混菌發(fā)酵可能產生了互利協同作用，從而增加了酸溶蛋白的含量，提高蛋白品質。

2.3 發(fā)酵底物對小麥酒精糟發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵底物組成對發(fā)酵結果的影響見表6，結合表1可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基組成的改變，含水量增加，物料損失也呈線性增加(p<0.05)。第3和4組發(fā)酵后酸溶蛋白含量最高，顯著高于其他3組(p<0.05)。雖然第1組的物料損失最小(p<0.05)，但其酸溶蛋白提高量較低。發(fā)酵底物中的水分對發(fā)酵效果影響較大，水分含量過低將不利于酶的擴散，影響酶的作用效果，水分含量過高則有利于厭氧菌的生長，但對好氧菌不利，且易霉變[5]，實際生產中常選用較低的含水量。因此固體厭氧發(fā)酵時，發(fā)酵底物的含水量應控制在一個合適的范圍內才有利于菌體的生長和酶的作用。第2組發(fā)酵物的酸溶蛋白含量提高量最大，物料損失較小，因此選擇發(fā)酵底物組成為：小麥酒精糟38%、次粉62%。

表6 不同發(fā)酵底物成對發(fā)酵結果的影響Table 6 Effects of different media compositions on substrates

2.4 接種量對小麥酒精糟發(fā)酵結果的影響

不同菌液接種量對發(fā)酵結果的影響見表7，隨著接種量的增加，酸溶蛋白含量逐漸增加(線性p<0.05，二次p<0.05)。通過提高菌液添加量，可提高菌種生長繁殖及生成代謝產物的時間，從而提高了酸溶蛋白含量[26]。當接種量為1.2%和1.4%時，發(fā)酵產物中的酸溶蛋白含量顯著高于其他3組(p<0.05)。接種量對粗蛋白的影響差異不顯著。隨著接種量的增加，發(fā)酵產物的pH呈線性降低(線性p<0.05，二次p>0.05)，揮發(fā)性鹽基氮的含量呈線性增加(線性p<0.05，二次p>0.05)。接種量過低，菌體生長遲緩，不利于一些酶及產物的生成；接種量過大，菌體繁殖過快，發(fā)酵底物的營養(yǎng)物質消耗過快，且副代謝產物會影響酶的合成與大分子蛋白的降解[27]。結果表明，菌液添加量為1.2%，即培養(yǎng)基中R-02菌液濃度為1.02×109CFU/g，KG109菌液濃度為1.68×108CFU/g時發(fā)酵效果最好。

表7 不同接種量對發(fā)酵結果的影響Table 7 Effect of different inoculation amount onfermentation results

2.5 發(fā)酵時間對小麥酒精糟發(fā)酵結果的影響

發(fā)酵時間也是固態(tài)厭氧發(fā)酵的重要參數，時間過短時菌體生長和代謝不充足，產酶較少，發(fā)酵不充分；當發(fā)酵時間過長時染菌幾率增加，并且會影響工藝進程。發(fā)酵時間對小麥酒精糟發(fā)酵效果的影響如表8所示，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵產物的酸溶蛋白呈顯著增加(線性p<0.05，二次p<0.05)，第6天和第7天差異不顯著。當發(fā)酵時間越長，發(fā)酵產物的pH顯著降低(線性p<0.05，二次p<0.05)，揮發(fā)性鹽基氮的含量呈線性增加(線性p<0.05，二次p>0.05)。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵小麥酒精糟顏色逐漸加深，酸香味逐漸濃郁，這表明前期發(fā)酵以枯草芽孢桿菌的好氧發(fā)酵為主，快速消耗氧氣并降解發(fā)酵基質中大分子蛋白，后期發(fā)酵以乳酸菌的厭氧發(fā)酵為主，產生大量芳香物質，改善發(fā)酵小麥酒精糟的風味。但發(fā)酵時間過長，則揮發(fā)性鹽基氮含量會越來越高，且周期相應延長[26]。

表8 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵結果的影響Table 8 Effects of different fermentation times onfermentation results

2.6 發(fā)酵溫度對小麥酒精糟發(fā)酵結果的影響

每種菌都有其最適的生長溫度，每種酶也都有其最適的反應溫度。因此發(fā)酵時應選擇合適的溫度，才能達到較好的效果。不同發(fā)酵溫度的發(fā)酵結果如表9所示，隨著發(fā)酵溫度升高，發(fā)酵產物的酸溶蛋白含量顯著降低(線性p<0.05，二次p<0.05)。隨著發(fā)酵溫度的增加，pH值呈線性增加(線性p<0.05，二次p>0.05)，揮發(fā)性鹽基氮的含量顯著增加(線性p<0.05，二次p<0.05)。發(fā)酵溫度會影響微生物的生長與繁殖、酶的活性及代謝產物，有研究表明發(fā)酵溫度過高會產生較多揮發(fā)性鹽基氮[21]，影響發(fā)酵風味。37 ℃下發(fā)酵，粗蛋白含量最低，但酸溶蛋白含量并不是最高，可能由于大量腐敗菌繁殖，降解粗蛋白，產生了大量的揮發(fā)性鹽基氮。結果表明，33 ℃時發(fā)酵較好，因為復合菌株包括枯草芽孢桿菌和乳酸菌，在33 ℃條件下，既能促進枯草芽孢桿菌和乳酸菌的生長，又能使菌體代謝產生的活性物質含量達到最大，從而使發(fā)酵效果達到較好。

表9 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵結果的影響Table 9 Effects of different fermentation temperatureson fermentation results

2.7 發(fā)酵小麥酒精糟響應面優(yōu)化

2.7.1 回歸模型的建立及其分析

發(fā)酵小麥酒精糟酸溶蛋白的響應面結果見表10。采用Design Expert 8.0.5.0軟件中的BBD對試驗結果進行響應面分析，得到回歸模型方差分析表，結果如表11和表12所示。由表11可知，模型的一次項ABC，交互項BC，各二次項影響均極顯著。各因素的貢獻率為C>B>A，即發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量。

通過多元回歸擬合分析得到酸溶蛋白與各變量(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間)的二次多項式方程：

Y=4.22+0.057A+0.11B+0.21C+0.043BC-0.28A2-0.16B2-0.15C2。

對上述模型方程的方差分析表明，本試驗模型p<0.000 1，說明二次回歸模型是極顯著的。由表12可知，回歸方程因變量與自變量之間的線性關系顯著，相關系數R2=0.994 8，說明此模型能解釋99.48%響應值變化；變異系數較低(0.71%)，說明試驗重復性較好。根據方差分析(表11)可知，失擬項不顯著(p=0.43>0.1)，說明模型與實際試驗擬合程度好，預測值和實際值之間具有高度的相關性，數據中無異常點，模型適當，分析結果可靠，可以應用于小麥酒精糟發(fā)酵的理論預測。

表10 Box-Benhnken響應面試驗設計及結果Table 10 Box-Benhnken response surface design and results

表11 響應面結果方差分析 Table 11 Analysis of variance of experimental results of response surface

注：*表示統(tǒng)計結果顯著，**表示統(tǒng)計結果極顯著。

表12 二次回歸方程的方差分析Table 12 Analysis of variance of the quadratic model

2.7.2 響應曲面優(yōu)化分析

利用 Design Expert 8.0.5.0 軟件對回歸模型進行規(guī)范分析，根據回歸方程，可得到接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間3個因素交互影響發(fā)酵小麥酒精糟酸溶蛋白的等高線圖和相應的響應面分析圖，如圖1～圖3所示。圖1、圖2、圖3分別表示接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間3個因素中1個因素取0點時其余2個因素對酸溶蛋白含量的影響。

通過二次多項回歸方程所作響應曲面圖及其等高線圖，可以直觀地反映出發(fā)酵條件對酸溶蛋白的影響，等高線的形狀可揭示出各因素之間交互效應的強弱大小，橢圓形表示2個因素交互作用顯著，而圓形則相反。由圖1可以看出，酸溶蛋白隨著菌液接種量的增加先上升后下降，隨發(fā)酵溫度的升高，亦先上升后逐漸下降，等高線的形狀為圓形，說明菌液接種量和發(fā)酵時間交互作用不顯著。由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間和菌液接種量的增加，酸溶蛋白呈先上升后下降的趨勢，等高線的形狀為圓形，說明菌液接種量和發(fā)酵時間交互作用不顯著。由圖3可以看出，二者交互作用形成的曲面為拋物面，說明發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度之間存在交互作用。綜上可以看出，接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)存在極值點，通過該組動態(tài)圖即可確定各個因素的最佳水平范圍。根據 Design Expert 8.0.5.0軟件對試驗結果進行最優(yōu)化分析，確定最佳的發(fā)酵條件為：菌液接種量為1.22%，發(fā)酵溫度33.45 ℃，發(fā)酵時間為6.78 d，在此條件下預測發(fā)酵小麥酒精糟的酸溶蛋白含量為4.33%。

圖1 發(fā)酵溫度和接種量對酸溶蛋白含量影響的等高線及響應曲面圖Fig.1 Response surface and contour graph of the effects of fermentation temperature and inoculation amount on content of acid soluble protein

圖2 發(fā)酵時間和接種量對酸溶蛋白含量的等高線及響應曲面圖Fig.2 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and inoculation amount on content of acid soluble protein

圖3 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度對酸溶蛋白含量的等高線及響應曲面圖Fig.3 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and fermentation temperature on content of acid soluble protein

2.7.3 模型的驗證

采用模型預測最佳優(yōu)化條件，菌液接種量為1.22%，發(fā)酵溫度33.4 ℃，發(fā)酵時間為6.78 d，在該條件下進行小麥濕酒精糟的發(fā)酵試驗，重復3次，每次酸溶蛋白含量分別為4.29%，4.33%和4.34%，平均酸溶蛋白含量為4.32%，與理論預測值的相對誤差約為0.06%。其他各項指標差異如表13所示，可見，發(fā)酵小麥酒精糟可有效提高其適口性和營養(yǎng)價值。粗蛋白質含量由13.67%提高到13.75%(p<0.05)，酸溶蛋白由0.74%提高到4.32%(p<0.05)，揮發(fā)性鹽基氮含量由10.45 mg/100 g升高到45.43 mg/100 g(p<0.05)，pH值由5.38降低到3.98(p<0.05)，益生菌由6.95×107CFU/g提高到5.48×109CFU/g(p<0.05)，蛋白酶活性由72.10 U/g提高到196.14 U/g(p<0.05)。說明構建的模型可以很好地預測混菌固態(tài)發(fā)酵小麥酒精糟的過程。

表13 小麥酒精糟發(fā)酵前后營養(yǎng)價值變化Table 13 Changes in nutritional value before and afterfermentation of wheat distiller's grains

注：同行數據不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結論

本試驗以提高酸溶蛋白為目標，篩選出枯草芽孢桿菌KG109和乳酸菌R-02兩株高效菌株；發(fā)酵基質組成為：35%小麥酒精糟和65%次粉；最佳固態(tài)厭氧發(fā)酵條件為：菌液接種量為1.22%，發(fā)酵溫度33.4℃，發(fā)酵時間為6.78 d，在該條件下小麥酒精糟發(fā)酵產物的平均酸溶蛋白含量可達到4.32%。試驗表明固態(tài)發(fā)酵工藝對小麥酒精糟品質具有提升作用。

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