劉 燕 王 曦 劉學(xué)鋒 李林海鄭常明 夏茂華 張成林*

(1.北京動物園，北京，100044；2.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044；3.國家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京，100010)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是我國特有的瀕危珍稀物種。根據(jù)全國第4次大熊貓調(diào)查的結(jié)果，野生大熊貓分布在秦嶺、岷山、鄧峽山、大相嶺、小相嶺、涼山6大山系，共有1 862只。圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)到375只。北京動物園作為國內(nèi)少數(shù)飼養(yǎng)有大熊貓的動物園之一，對大熊貓的飼養(yǎng)非常重視。

腸道菌群對大熊貓機(jī)體健康有重要影響[1-2]，其菌群多樣性也受到飲食結(jié)構(gòu)和生活地域的影響[3]。3只大熊貓F(tuán)、D和E出生后(其中大熊貓D和大熊貓E是1對雙胞胎)，一直飼養(yǎng)于成都，于2014年10月回到北京動物園飼養(yǎng)。3只大熊貓剛回到北京動物園飼養(yǎng)后，即14月齡時，采集新鮮糞便，并于2月后，3只大熊貓?jiān)诒本﹦游飯@熊貓館的生活已經(jīng)基本穩(wěn)定并已形成穩(wěn)定的腸內(nèi)菌群以后再次采集新鮮糞便，采用高通量測序技術(shù)對糞便內(nèi)細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究3只大熊貓?jiān)?4月齡時從成都回到北京動物園飼養(yǎng)后，糞便菌群是否發(fā)生較大變化，探討其是否能很好地適應(yīng)新的環(huán)境。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 樣品采集

采集北京動物園3只亞成體圈養(yǎng)大熊貓糞便樣本19份，其中剛從成都回到北京動物園時(14月齡)的新鮮糞便樣本共10份(n=3)，編號為F14_1、F14_2、F14_3、F14_4、F14_5，D14_1、D14_2、D14_3，E14_1、E14_2；2個月后新鮮糞便(16月齡)樣本共9份(n=3)，編號為F16_1、F16_2、F16_3，D16_1、D16_2、D16_3、D16_4，E16_1、E16_2。

糞便采集時，戴無菌一次性手套用無菌棉簽，從新鮮糞便內(nèi)部采集10 g左右，用液氮保存后到回實(shí)驗(yàn)室，放入-80℃冰箱保存待檢。

1.2 測序準(zhǔn)備

1.2.1 基因組DNA抽提

用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit試劑盒提取大熊貓糞便中的基因組DNA。具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。合格后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增及測序

以大熊貓基因組DNA為模板，利用正向引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，反向引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，擴(kuò)增16S rRNA基因的V3+V4區(qū)域。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mM dNTPs 2μL，上游引物(5μM)0.8μL，下游引物(5μM)0.8μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA 10 ng，然后補(bǔ)ddH2O至20μL。PCR 儀為ABI GeneAmp?9700 型。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；共27個循環(huán)，72℃ 10 min，最后保持在10℃。每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物3μl上樣電泳檢測。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和回收

合格樣本，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收純化PCR產(chǎn)物。

2 高通量測序

2.1 測序

擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行高通量商業(yè)化測序。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 測序結(jié)果分析

經(jīng)MiSeq測序得到的PE reads，根據(jù)Overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，然后對序列質(zhì)量進(jìn)行過濾和質(zhì)控。

2.2.2 物種組成分析

應(yīng)用軟件Usearch(Version 7.0)在相似性為97%的條件下，對OUT的代表序列進(jìn)行聚類分析和物種分類學(xué)分析。

2.2.3 Alpha多樣性分析

應(yīng)用Mothur軟件(Version v.1.30.1)進(jìn)行Chao、Coverage、Shannon、Simpson 4種常用指數(shù)的測定?；贠UT聚類分析的結(jié)果，再進(jìn)行多樣性指數(shù)分析和測序深度檢測。

2.2.4 Beta多樣性分析

應(yīng)用QIIME軟件(Version 1.9.1)進(jìn)行分析。根據(jù)各個樣品OUT的種類及豐度，根據(jù)Bray_curtis距離進(jìn)行作圖，R值越接近1表示組間差異越大于組內(nèi)差異，R值越小則表示組間和組內(nèi)沒有明顯差異。基于物種分類學(xué)分析的結(jié)果，在各個分類水平上，進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的分析；在上述分析的基礎(chǔ)上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗(yàn)等一系列深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)以及可視化分析。

3 結(jié)果

3.1 測序結(jié)果

19份大熊貓糞便樣品經(jīng)過測序，共獲得698 191條有效序列，平均每個樣品含有36 746條序列，每條序列的平均長度是445 bp。這些序列共分屬于9個門、16綱、27目、45科、75屬、103種、138個OUT。其中124個OUT為14月齡和16月齡共享OUT(圖1)；大熊貓F(tuán)、D和E共享OUT為90個(圖2)。

圖1 14月齡組和16月齡組糞樣細(xì)菌OUT維恩圖Fig.1 Venn diagram showing the OTUs of fecal bacteriabetween 14 months and 16 months

圖2 大熊貓F(tuán)、D和E糞樣細(xì)菌OUT維恩圖Fig.2 Venn diagram showing the OTUs of fecal bacteriaof panda F、D and E

3.2 物種組成分析

本次測定大熊貓糞便菌群主要屬于變形菌門(Proteobacteria)平均占55.5%，厚壁菌門(Firmicutes)平均占42.5%和藍(lán)菌門(Cyanobacteria)平均占1.68%。

在屬水平上，大腸志賀氏桿菌屬(Escherichiashigella)平均占50.1%，狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)平均占13.8%，鏈球菌屬(Streptococcus)平均占11.7%，乳桿菌屬(Lactobacillus)平均占4.9%，未分類的藍(lán)細(xì)菌(Norank-c-Cyanobacteria)平均占1.7%。

14月齡和16月齡組間比較，發(fā)現(xiàn)乳球菌屬(Lactococcus)差異顯著(P<0.05)，16月齡高于14月齡。其他屬之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)，大熊貓F(tuán)、D和E之間差異不顯著(P>0.05)。

3.3 Alpha多樣性分析

19份樣品的序列覆蓋率Coverage均達(dá)到99.9%以上。14月齡和16月齡組間4種指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。大熊貓F(tuán)、D和E之間4種指數(shù)差異也都不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 19份樣品多樣性指數(shù)

Tab.1 Diversity estimation of nineteen samples

續(xù)表1

圖3 14月齡和16月齡組間多物種差異檢驗(yàn)柱形圖Fig.3 Wilcoxon rank-sum test bar plot between 14 months and 16 months

圖5 大熊貓糞便細(xì)菌PCoA聚類圖(百分?jǐn)?shù)代表了樣品受主成分影響下的相似性距離)Fig.5 PCoA diagram reflecting clustering of fecal bacillus of panda(The percentages represented the similarity distance under influence of PC)

3.4 Beta多樣性分析

從圖4可以看出，其R值為0.074，說明組間和組內(nèi)沒有明顯差異，但也可以說明大熊貓F(tuán)和D、F和E之間的細(xì)菌群落差異性大于D和E之間的細(xì)菌群落差異性。

同時，樣品進(jìn)行了聚類分析并繪制了PCoA 聚類圖(圖5)。可以看出，除了樣品E14_2外，其他18個樣品聚集度非常高。無論是按照大熊貓個體分組，還是按照月份分組，樣品在圖上并沒有依據(jù)其組別而表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集。再次印證14月齡和16月齡之間、大熊貓F(tuán)、D和E之間差異不顯著。

圖4 在屬水平大熊貓F(tuán)、D和E組間距離盒狀圖Fig.4 Distance calculated on genus level of panda F、D and E

4 討論

高通量測序技術(shù)，是近幾年來才建立的一種研究菌群組成的全新技術(shù)[4-9]，與以往的研究方法相比較，能夠比較全面地反應(yīng)出樣品中微生物的種類[10-11]。很多珍稀瀕危動物都通過該方法進(jìn)行了腸道菌群分析。已有的研究表明人的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes division)、變形菌門[12-13]；老虎腸道優(yōu)勢細(xì)菌為厚壁菌門、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門[14]；健康成年川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)糞樣菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主[15]；大熊貓腸道優(yōu)勢細(xì)菌為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門[16]；本研究發(fā)現(xiàn)，3只亞成體大熊貓優(yōu)勢菌群與以往研究基本相似，主要是變形菌門和厚壁菌門，但是變形菌門比例略高于厚壁菌門。一般當(dāng)環(huán)境因子改變后1個月即可形成穩(wěn)定菌群，為了結(jié)果更加準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)選擇2個月進(jìn)行采樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3只大熊貓?jiān)趧倓偦氐奖本﹦游飯@和飼養(yǎng)2個月后，糞便菌群基本沒有顯著差異，說明14月齡的大熊貓腸道菌群已經(jīng)基本穩(wěn)定，可以適應(yīng)一定程度的環(huán)境改變。同時也說明，北京動物園提供的飼料基本滿足了其需要。乳球菌屬是唯一有顯著差異的屬，所占比例從剛回園的0.79%，2個月后上升為2.73%。乳球菌屬細(xì)菌比較常見，無致病性，是腸道內(nèi)正常菌群之一。目前經(jīng)常被用作輪狀病毒、HBV、HCV和腸道病毒等消化道病毒疫苗的新型疫苗載體[17-18]。本例中乳球菌屬比例的上升是大熊貓隨著年齡的增長，腸道菌群正常發(fā)育的表現(xiàn)，還是環(huán)境改變所造成的還值得探討。

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