翟少華 賈欽瑞 李淑嫻 姚 剛

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊，830052)

牛蛙屬兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)，是一種大型的食用型蛙。目前人工養(yǎng)殖量較大，且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。皮膚作為兩棲動物棲息環(huán)境直接接觸的器官，在進(jìn)化過程中形成了機(jī)體與環(huán)境間的第一道天然屏障，對維持動物自身生存和適應(yīng)棲息地多樣化的生態(tài)環(huán)境起著重要的作用。牛蛙皮膚顯微結(jié)構(gòu)及組織化學(xué)方面的研究已有報(bào)道[1-2]，但對于其皮膚的比較組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)研究仍鮮見報(bào)道。本文通過制作牛蛙皮膚組織的石蠟切片進(jìn)行蘇木紫-伊紅(HE)染色，通過Masson氏三色法和Mallory磷酸蘇木紫染色法進(jìn)行特染，及采用透射電鏡技術(shù)對牛蛙皮膚不同部位皮膚進(jìn)行組織學(xué)觀察，旨在確定牛蛙皮膚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為皮膚及皮下組織細(xì)胞間形態(tài)學(xué)的研究提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康牛蛙2只，購于新疆烏魯木齊市北園春農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

10%中性福爾馬林溶液、無水乙醇、二甲苯、1%氨水、1%鹽酸酒精、伊紅染液、蘇木素染液、固體石蠟、Bouin氏固定溶液、Weigert氏蘇木紫工作液、猩紅-酸性復(fù)紅溶液、磷鉬酸-磷鎢酸溶液、苯胺藍(lán)溶液、1%冰醋酸溶液、磷鎢酸蘇木紫溶液、0.5%高錳酸鉀溶液、1%草酸溶液、3%重鉻酸鉀溶液、2.5%戊二醛、1%鋨酸、環(huán)氧樹脂、0.1 M PBS緩沖液、甲醛、乙醇、丙酮、1%戊巴比妥鈉、0.2 M磷酸氫二鈉、0.2 M磷酸二氫鈉，均購置新疆烏魯木齊市華利科希實(shí)驗(yàn)試劑公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

透射電子顯微鏡(型號為H-600)，購于日本日立公司；生物組織包埋機(jī)(型號為BMJ-1)，購于天津天利航空有限公司；控溫儀(型號為KW-1)；生物組織染色機(jī)(型號為RS-18Ⅱ)，購于湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；萊卡2050型石蠟組織切片機(jī)(德國萊卡公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號為HH-S)，購于江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；光學(xué)顯微鏡，購于尼康儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石蠟切片制備與HE染色

首先將實(shí)驗(yàn)動物牛蛙頸部脫臼處死，從腹白線位置開始剝?nèi)游锲つw組織。牛蛙所取的部位組織是頭部、背部、腰部、腹部、前肢、后肢皮膚于10%的甲醛溶液中固定24 h。固定后將皮膚組織流水沖洗3 h，系列酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.2 Masson氏三色法染色

將經(jīng)脫蠟處理的組織切片置于Bouin氏固定溶液，在56 ℃溫箱中1 h，流水沖洗10 min；再經(jīng)Weigert氏蘇木紫溶液染10 min，流水沖洗10 min；猩紅-酸性復(fù)紅溶液染15 min，切片置于蒸餾水中清洗；以磷鉬酸-磷鎢酸溶液染10 min做分色，檢查膠質(zhì)纖維沒有被染成紅色；使用苯胺藍(lán)液做對比染色5 min；以1%冰醋酸分色3 min；以95%酒精，絕對酒精及二甲苯脫水及透明，晾干后封片。

1.2.3 Mallory 氏磷鎢酸蘇木紫染色

將經(jīng)脫蠟處理的組織切片置于3%重鉻酸鉀溶液氧化作用3 h，輕輕水洗1 min；以0.5%高錳酸鉀溶液氧化作用15 min，迅速通過3次蒸餾水；浸入1%草酸溶液，脫色5 min，流水沖洗3 min；以蒸餾水浸洗，浸入磷鎢酸蘇木紫溶液過夜(或56～60 ℃，90 min)；浸入95%酒精除去殘留染色液，迅速通過3次絕對酒精脫水；浸入二甲苯透明2次，每次2 min，晾干后封片。

1.2.4 透射電鏡樣品制作

實(shí)驗(yàn)動物組織采用2.5%戊二醛固定液固定24 h后，1%鋨酸后固定系列乙醇脫水EPon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 牛蛙皮膚組織HE染色結(jié)果

在HE染色中，牛蛙皮膚細(xì)胞核呈紫色、膠原纖維呈粉紅色、彈性纖維著色極淺呈淺粉色；在真皮組織中可見數(shù)量較多的染色呈嗜堿性、著色較淺、呈淡紫色的成纖維細(xì)胞和橢圓形、體積較大的腺體分布(圖1)，主要為黏液腺和顆粒腺；其中黏液腺胞體較小，腺體內(nèi)有較多的漿液性的分泌液；此外可見有大量的黑色素細(xì)胞在表皮下與真皮層之間(圖2)；在黏液腺和黑色素顆粒層之間，有體積較小的顆粒腺存在。在腺體之下有大量的膠原纖維和彈性纖維，而細(xì)胞和基質(zhì)的成分較少，整體結(jié)構(gòu)較為致密。

圖1 牛蛙前肢皮膚：顆粒腺呈橢圓形(HE，10×10)Fig.1 Bullfrog forelimb skin：the granule gland is oval(HE，10×10)

圖2 牛蛙頭部皮膚：黑色素分布于真皮層(HE，10×20)Fig.2 Bullfrog head skin：melanin is distributed in the dermis (HE，10 × 20 )

2.2 牛蛙皮膚組織 Masson氏三色法染色結(jié)果

在Masson氏染色法中，牛蛙的表皮中角質(zhì)層被染成紅色，細(xì)胞核呈現(xiàn)黑紫色(圖3)。真皮層的腺體染色呈現(xiàn)粉紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色，腺體較HE染色更加明顯(圖4)，與腺體下方的膠原纖維形成鮮明的對比。

圖3 牛蛙背部皮膚：表皮層較薄，呈紫色(Masson，10×10)Fig.3 Bullfrog back skin：the epidermis is thinner and purple (Masson，10×10)

圖4 牛蛙背部皮膚：腺體染色呈紫紅色(Masson，10×20)Fig.4 Bullfrog back skin：the gland staining is purple red (Masson，10×20)

2.3 牛蛙和小鼠皮膚組織Mallory氏磷鎢酸蘇木紫染色結(jié)果

牛蛙的真皮下層組織有大量的神經(jīng)分布，在Mallory氏磷鎢酸蘇木紫染色中，膠原纖維呈現(xiàn)紅褐色，彈性纖維呈紫色，在真皮深層及皮下組織中，有大量有被囊的神經(jīng)末梢，呈圓形或橢圓形，為環(huán)層小體(圖5)。其被囊是由數(shù)十層同心圓排列的扁平細(xì)胞構(gòu)成，并且能清晰地看到神經(jīng)纖維的走向(圖6)，表明牛蛙皮下組織中神經(jīng)分布較為豐富。

圖5 牛蛙前肢皮膚：由數(shù)十層同心圓排列的環(huán)層小體結(jié)構(gòu)，呈橢圓形(Mallory，10×10)Fig.5 Bullfrog skin of bullfrog：the structure of the ring corpuscles arranged in concentric circles of dozens of layers is oval(Mallory，10×10)

圖6 牛蛙前肢皮膚：環(huán)層小體呈橢圓形，神經(jīng)分布較為密集、豐富(Mallory，10×20)Fig.6 The forelimb skin of bullfrog：the ring body is oval，and the nerve distribution is more dense and abundant(Mallory，10×20)

2.4 牛蛙皮膚組織透射電鏡結(jié)果

在電鏡下觀察，可見到基底膜(圖7)，這是表皮與真皮的分割線，將基底層和其下的真皮乳頭層分開(圖8)，基底層位于表皮最深層，其相鄰的細(xì)胞之間會通過橋粒進(jìn)行連接(圖9)。同時(shí)可見到形狀呈發(fā)散狀、星狀的黑素細(xì)胞(圖10)，在細(xì)胞質(zhì)中會有橢圓形的小體，稱為黑素小體。在真皮層組織中，有大量的血管和神經(jīng)分布。

圖7 基底膜：表皮與真皮層的分割線(10 000×)Fig.7 Basement membrane：dividing line between the epidermis and the dermis(10 000×)

圖8 基底層：基底層細(xì)胞位于最深層(5 000×)Fig.8 Basal layer：basal layer cells are located in the deepest layer(5 000×)

圖9 橋粒：分布于相鄰細(xì)胞之間(25 000×)Fig.9 Bridge particles：distributed between adjacent cells(25 000×)

圖10 黑素細(xì)胞：呈發(fā)散狀、星狀(8 000×)Fig.10 Melanocytes：divergent，stellate(8 000×)

2.5 牛蛙皮膚部位厚度測量比較結(jié)果

利用圖像分析軟件分別測量表皮和真皮的厚度，以微尺讀數(shù)進(jìn)行矯正。運(yùn)用Excel軟件對測定出來的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，應(yīng)用SPSS 21.0軟件單因素方差分析功能對牛蛙不同部位的皮膚進(jìn)行厚度比較，顯著差異水平為0.05。表1結(jié)果顯示：牛蛙皮膚不同部位間存在顯著差異，前肢和后肢部位皮膚厚度差異不顯著，背部和腰部的皮膚厚度差異不顯著，其中頭部皮膚厚度顯著小于其他部位(圖11)。

圖11 牛蛙皮膚厚度差異性比較Fig.11 Compare of bullfrog skin thickness

表1 牛蛙各部位皮膚測量數(shù)據(jù)結(jié)果

Tab.1 Result of bullfrog skin measurements data

3 討論

3.1 牛蛙皮膚表皮組織結(jié)構(gòu)

皮膚是身體最大的器官，也是形成身體連接的外在表面，牛蛙生活于淺水水域環(huán)境及離水不遠(yuǎn)的陸地，在水生向陸生的進(jìn)化中，兩棲類皮膚隨生活環(huán)境的改變而發(fā)生了適應(yīng)性的改變[3-5]。表皮一般由4～8層細(xì)胞構(gòu)成[6]，由于兩棲類皮膚表皮層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征不像哺乳類那樣明確，因此，暫且將牛蛙表皮細(xì)胞類型劃分為3類，即從外向內(nèi)依次為角質(zhì)層、中間層(包含了顆粒細(xì)胞層和棘細(xì)胞層) 和基底層。

牛蛙皮膚表皮角質(zhì)層的細(xì)胞沒有細(xì)胞核，輪廓也模糊不清，越往淺層相鄰細(xì)胞之間的橋粒解體，角質(zhì)細(xì)胞之間的連接會越松散。顆粒層也稱表皮粒層，位于棘細(xì)胞層的上一層，細(xì)胞的形狀扁平或者呈梭形，顆粒層的細(xì)胞最大的特點(diǎn)就是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有無數(shù)角質(zhì)透明質(zhì)蛋白的無外膜顆粒，稱為透明角質(zhì)顆粒。棘細(xì)胞間有無數(shù)的細(xì)胞棘突，這些棘突通過橋粒和周圍鄰近的細(xì)胞緊密連接，橋粒是無數(shù)稱為張絲的中間絲固著點(diǎn)，關(guān)于中間絲，通常是圍繞著細(xì)胞核開始組裝，并伸展到細(xì)胞邊緣與細(xì)胞質(zhì)膜上的細(xì)胞連接如橋粒、半橋粒相連[7]。基底層的細(xì)胞的分化增殖能力非常強(qiáng)，會有新生的細(xì)胞不斷地向棘細(xì)胞層移動，分化成表皮的棘細(xì)胞層細(xì)胞以及其余幾層細(xì)胞?；啄t是沿著真皮乳頭這些凹凸不平的突起，迂回地覆蓋在表面[8]。

3.2 牛蛙皮膚腺體功能

牛蛙皮膚及其分泌物中包含了種類繁多、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，具有特殊的生理和藥理作用，是重要的藥物資源[9]。兩棲類動物皮膚裸露、潮濕，這無疑給微生物提供了一個(gè)極好的生存環(huán)境，但在長期的自然選擇過程中，它們逐漸形成了防御機(jī)制，即從特定的腺體分泌防御物質(zhì)到背部、腹部皮膚及腸腔來抵御有害環(huán)境因子的侵襲。因此，兩棲動物皮膚是這些防御物質(zhì)最為豐富的源泉。牛蛙皮膚的真皮層顆粒腺的數(shù)目較多，黏液腺的分布較廣[1]，不同部位的黏液腺和顆粒腺分布也略有不同。黏液腺內(nèi)腔一般中空，但是會有些腺體細(xì)胞脫落進(jìn)入內(nèi)腔[2]。黏液腺分泌黏液，分泌的黏液覆蓋在身體的表面形成一層濕潤的薄膜，具有防御、保濕、皮膚呼吸、溫度調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)等作用。顆粒腺分泌部體積較黏液腺大，它分泌的毒素更是可以提供抗菌肽[10]，這些腺體是兩棲動物防御天敵，保護(hù)自身，更是捕食的重要手段，是作為兩棲類動物特有的腺體。

4 結(jié)論

通過細(xì)胞化學(xué)染色方法和透射電鏡技術(shù)觀察結(jié)果顯示，牛蛙表皮結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外依次為基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、角質(zhì)層；在牛蛙真皮層有大量的腺體，主要為黏液腺和顆粒腺，并有大量的黑色素散布于表皮與真皮組織之間。牛蛙皮膚不同部位間存在顯著差異，皮膚各部位厚度差異依次為(腰部>背部>前肢>后肢>頭部)。通過以兩棲類動物牛蛙為研究模型，從皮膚組織顯微和超微形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探討其組織結(jié)構(gòu)與生理功能的關(guān)系，以及研究皮膚及皮下組織細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞提供形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。

[1] 宋晶，陳祎寧，劉曉玲，等.牛蛙不同體部皮膚的組織學(xué)研究[J].畜牧與飼料科學(xué)，2016，37(1)：24-27.

[2] 周作紅，彭沙沙，鐘圣偉，等.牛蛙皮膚顯微結(jié)構(gòu)與組織化學(xué)研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35(3)：438-443.

[3] 張賢芳，張耀光，王志堅(jiān)，等.中華蟾蜍皮膚的組織學(xué)觀察[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，24(5)：454-457.

[4] 沈霞芬.家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[5] 費(fèi)梁，胡淑琴，葉昌媛，等.中國動物志：兩棲綱(下卷)無尾目 蛙科[M].北京：科學(xué)出版社，2009：165-246.

[6] 高鳳娟，李丕鵬.王譯唱，等.西藏蟾蜍皮膚的組織學(xué)觀察[J].四川動物，2016，35(3)：444-451.

[7] 翟中和，王喜忠，丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)[M].4版.北京：高等教育出版社，2011.

[8] 封根泉，郭玉璞.電子顯微鏡下的動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)[J].動物學(xué)雜志，1978(4)：44-46.

[9] 李洋，金磊，李昌春，等.黑斑蛙、虎紋蛙和牛蛙皮膚的比較組織學(xué)[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，32(5)：466-470.

[10] 李洋.三種蛙皮膚組織結(jié)構(gòu)、生物活性物質(zhì)的定位及其提取物的抑菌比較研究[D].蕪湖：安徽師范大學(xué)，2010.