陳茂金黃海玲付黨華黃 萃鄔向東*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院，南昌，330045；2.南昌市動(dòng)物園管理處，南昌，330006)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)是中國(guó)的十大瀕危動(dòng)物之一、國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，紅色物種名錄極度瀕危，在野外已滅絕。目前南昌市動(dòng)物園飼養(yǎng)著20多只圈養(yǎng)華南虎，為更好保護(hù)該虎群，采集華南虎新鮮糞便，進(jìn)行了細(xì)菌分離，通過擴(kuò)增16S rRNA基因片段分析，確定分離到一株遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)。

該菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，愛德華氏菌屬。為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜，是一種人畜共患病[1]病原。1962年首次由日本科學(xué)家Hoshina從發(fā)病鰻鱺(Anguillajaponica)體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)[2]。該菌常發(fā)病于水產(chǎn)動(dòng)物中，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的危害，造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失；其他動(dòng)物報(bào)道較少，尚無(wú)從虎腸道內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)的報(bào)道[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

華南虎糞便，采于江西南昌市動(dòng)物園內(nèi)一雌性成年華南虎新鮮糞便，糞便偏軟但成形，無(wú)其他可見臨床癥狀。

1.1.2 引物

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物一對(duì)，由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下：

16S(F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

16S(R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

1.1.3 主要試劑

小牛血清，杭州江濱生物技術(shù)有限公司；PCR Mix、100bp DNA Ladder購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙啶(EB)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega；Tris堿購(gòu)自Solarbio公司；SDS、Agarose購(gòu)自Sigma公司。

1.1.4 主要設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5415R冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf；PCR儀，杭州晶格儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離

無(wú)菌操作將約5 g華南虎糞便放入燒杯，并加入95 mL無(wú)菌生理鹽水混勻做100倍稀釋；靜置10 min后，取上清做10倍剃度稀釋。選擇10-6、10-7、10-83個(gè)稀釋度用無(wú)菌棉簽蘸取糞便稀釋液涂布血清培養(yǎng)基，置37℃電熱恒溫箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)基內(nèi)勾取單個(gè)、孤立菌落，進(jìn)行純化獲得菌株；從中選擇典型分離株進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定

1.2.2.1 菌液制備

取7支無(wú)菌5 mL試管，每支加入3 mL LB液體培養(yǎng)基，分別將7個(gè)分離菌株挑單個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。待培養(yǎng)基渾濁后停止振蕩，取出試管，供提取細(xì)菌DNA模板之用。

1.2.2.2 細(xì)菌DNA提取

取1 mL對(duì)數(shù)期菌液，12 000 rpm離心3 min棄上清。加入0.6 mL TE重懸細(xì)菌，12 000 rpm離心3 min棄上清，加入100 μL雙蒸水煮沸12～18 min；再12 000 rpm離心5 min，取上清即為提取細(xì)菌DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系(25 μL)：16S(F)，1.0 μL；16S(R)，1.0 μL；PCR Mix，12.5 μL；模板 DNA，1.0 μL；ddH2O，9.5 μL；Total 25.0 μL。

PCR 反應(yīng)條件：按上述體系，將引物、PCR Mix、dNTP、細(xì)菌DNA模板依次加入無(wú)菌 0.2 mL EP管中，將EP管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴(kuò)增條件進(jìn)行DNA擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增條件94℃ 40 s，55℃ 50 s，72℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min結(jié)束擴(kuò)增。

取出反應(yīng)管，從中吸取6 μL在1%的瓊脂糖凝膠中，電泳30 min。在紫外分析儀下觀察擴(kuò)增結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送檢測(cè)序

將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測(cè)通測(cè)序。

1.2.4 序列分析

將測(cè)序得到的7個(gè)序列用NCBI中Blast工具進(jìn)行相似性比較。根據(jù)比較的結(jié)果，選取參考菌株，采用MEGA6.05軟件，用N-J法、ML法、MP法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)集為1 000。

1.2.5 分離菌株藥敏實(shí)驗(yàn)

麥?zhǔn)媳葷岱ù_定菌液細(xì)菌濃度對(duì)應(yīng)3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)管(約9×108/mL)，在血清培養(yǎng)基平板上進(jìn)行紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈的直徑大小，按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定菌株對(duì)不同藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

分離細(xì)菌經(jīng)純化培養(yǎng)獲得24個(gè)菌株；分離細(xì)菌在血清培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后菌落形態(tài)大致相似：灰白色、半透明、中間略微凸起、邊緣整齊、表面光滑且濕潤(rùn)；革蘭氏染色呈陰性，鏡檢呈短桿狀，無(wú)芽孢。從中選擇7個(gè)典型分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分別命名為NCH01～NCH07。

2.2 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

7個(gè)分離菌株經(jīng)過PCR擴(kuò)增出約1 500 bp大小的基因片段(圖1)。

圖1 NCH01-NCH07分離菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of 16S rDNA amplification product of NCH01-NCH07 isolated strain 注：M為100 bp DNA Ladder；1～7分別為菌株NCH01～NCH07 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物；8為陰性對(duì)照 Note：M is 100 bp DNA ladder；1-7 is the 16S rDNA amplification product of strain NCH01-NCH07；8 is a negative control

2.3 測(cè)序及序列分析結(jié)果

經(jīng)過PCR擴(kuò)增的7個(gè)分離菌株的16S rRNA基因測(cè)序后分別與GenBank中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌株NCH01、NCH02、NCH04、NCH05、NCH06、NCH07的16S rRNA基因與大腸桿菌(Escherichiacoli)的同源性均達(dá)到99%；而NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)同源性達(dá)到100%(圖2)。分離菌株NCH03的16S rRNA基因片段長(zhǎng)度為1 414 bp(圖3)。

選取遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、?？茞鄣氯A氏菌(Edwardsiellahoshinae)、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)、粘放線菌(Moritellaviscosa)、人肺炎桿菌(Cardiobacteriumhominis)菌株與分離菌株NCH03的16S rRNA基因采用鄰接法(Neighbor-Joining)、最大似然法(Maximum likelihood)、最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果都顯示分離菌株NCH03與遲緩愛德華氏菌屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近?？纱_定分離菌株NCH03為遲緩德華氏菌(圖4)。

圖2 NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)對(duì)比圖Fig.2 The Comparison Chart of NCH03 16S rRNA gene with Edwardsiella tarda strain Su100 16S rRNA gene(AB050829.1)

圖3 菌株NCH03 16S rRNA基因部分序列Fig.3 Part of the sequence of the strain NCH03 16S rRNA gene

(a)

(b)

(c)圖4 3種方法構(gòu)建NCH03 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(a.N-J法，b.ML法，c.MP法)Fig.4 Three methods of constructing NCH03 16S rRNA gene phylogenetic tree(a.Neighbor-Joining，b.Maximum likelihood，c.Maximum parsimony)

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離菌株NCH03對(duì)20種藥物敏感性測(cè)定結(jié)果如表1，結(jié)果表明：NCH03菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、替卡西林-克拉維酸、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻肟、妥布霉素、氧氟沙星、呋喃妥因敏感；對(duì)卡那霉素中敏；對(duì)頭孢他啶、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、諾氟沙星耐受。

表1 分離菌株NCH03對(duì)20種藥物的敏感性

Tab.1 Sensitivity of strain NCH03 to 20 kinds of drugs

注：S敏感；I中等敏感；R抗性

Notes：S Sensitive；I Intermediate；R Resistant

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)從華南虎新鮮糞便內(nèi)隨機(jī)分離到24株菌株，選取7株菌株(命名為NCH01到NCH07)提取其DNA作為模板，通過擴(kuò)增16S rRNA基因進(jìn)行同源性分析，初步鑒定菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌，其他6株菌株為大腸桿菌。采用菌株NCH03 16S rRNA基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以進(jìn)一步確認(rèn)菌株NCH03分類地位。結(jié)果表明NCH03與遲緩愛德華氏菌同源性為100%且在系統(tǒng)發(fā)育樹上為一聚類，確定分離菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌。NCH03菌株對(duì)20種藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示對(duì)10種藥物敏感，9種藥物耐受，一種藥物處于耐受于敏感之間。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)新鮮華南虎糞便菌群進(jìn)行人工培養(yǎng)和16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序鑒定，從而反映出華南虎腸道菌群構(gòu)成情況。為判斷圈養(yǎng)華南虎腸道健康狀況提供依據(jù)。對(duì)實(shí)驗(yàn)中分離到的一株遲緩愛德華氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該圈養(yǎng)華南虎治療遲緩愛德華氏菌感染用藥的選擇提供參考，能更好地保護(hù)該華南虎群，也為華南虎源遲緩愛德華氏菌后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

遲緩愛德華氏菌廣泛分布在水環(huán)境中，既能感染多種海水淡水魚類，也能感染兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物等[1，4-6]。宣云峰等[7]從加州鱸(Micropterussalmoide)內(nèi)分離出遲緩愛德華氏菌。鄧顯文等[8]從羅非魚(Oreochromisspp.)內(nèi)分離鑒定了遲緩愛德華菌。周常義[9]等人從兩棲動(dòng)物牛蛙(Ranacatesbeiana)分離到該菌。陳宗淦，陸亢興等[4-5]發(fā)現(xiàn)人感染遲緩愛德華氏菌的病例。目前尚無(wú)華南虎感染該菌的報(bào)道。

遲緩愛德華氏菌感染途徑較多，許多動(dòng)物腸道和水體中都含有該菌，接觸帶毒動(dòng)物糞便和飲用污染的水源，都可能被感染，從而顯現(xiàn)一些臨床癥狀[10]，嚴(yán)重危害動(dòng)物和人的健康。如牙鲆(Paralichthysolivaceus)感染引起腹部膨脹，內(nèi)有膿液狀腹水，肝腎腫大并伴有出血癥狀[11]；牛蛙感染引起腹水病[9]；海獅感染引起活動(dòng)異常、采食量減少、無(wú)力等；人感染后可引起腸胃疾病、敗血癥等[10]。因此，飼養(yǎng)華南虎時(shí)應(yīng)注意飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，勤打掃消毒，飼喂干凈水和食物，防止水和食物被該菌污染。這才能更好地保護(hù)華南虎。

目前遲緩愛德華氏菌病治療多以抗生素為主，容易產(chǎn)生耐藥性。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)華南虎糞便分離菌株NCH03進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌對(duì)20種藥物中的10種耐藥，具有較強(qiáng)的耐藥性。這也加大了保護(hù)瀕危動(dòng)物華南虎的難度。中藥防治疾病時(shí)具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥菌的特點(diǎn)。劉克奉等[12]研究了6種中藥對(duì)遲緩愛德華氏菌的抑制作用，為使用中藥防治該病提供了重要依據(jù)。

[1] 劉春，李凱彬，王慶，等.斑馬魚遲緩愛德華氏菌的鑒定、致病性及藥物敏感性[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32(3)：105-111.

[2] 邵建春.黃鱔源遲緩愛德華氏菌的鑒定、分型及全基因組測(cè)序[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[3] 葉旭紅，林先貴，王一明.養(yǎng)殖澳洲寶石魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及致病基因的檢測(cè)[J].淡水漁業(yè)，2010，40(1)：50-54.

[4] 陳宗淦，朱江，魏威，等.遲緩愛德華氏菌敗血癥3例[J].大理醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，7(3)：54-55.

[5] 陸亢興.愛德華氏菌致肝膿腫[J].臨床檢驗(yàn)雜志，1990，8(3)：164.

[6] 吳斌，樊海平，曾占?jí)?，?歐洲鰻鱺肝腎病病原菌的分離與鑒定[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，40(11)：51-56.

[7] 宣云峰，沈勇亮，楊小猛，等.加州鱸遲緩愛德華氏菌病的檢測(cè)和防治[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2014，35(10)：8-10.

[8] 鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.羅非魚遲緩愛德華氏菌的分離與鑒定[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2(1)：114-117.

[9] 周常義，陳曉鳳，何仲京.牛蛙遲緩愛德華氏菌變異株K的分離與鑒定[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，9(1)：26-31.

[10] 王波，莫照蘭.遲緩愛德華氏菌及其致病機(jī)理[J].海洋科學(xué)集刊，2007，48：133-139.

[11] 張?jiān)￡?yáng)，王維娜，王軍霞，等.牙鲆愛德華氏菌病的研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2003，22(1)：34-36.

[12] 劉克奉.6種中草藥對(duì)2株致病菌的抑菌效果比較[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2013，34(10)：49-54.